Амплификация нуклеиновых кислот при коронавирусе что это

Амплификация нуклеиновых кислот при коронавирусе что это

Своевременная и качественная диагностика – один из ключевых факторов в борьбе с COVID-19: диагностика необходима и для оценки общей эпидемиологической ситуации, и в случае принятия решения по каждому конкретному пациенту. По данным сайта стопкоронавирус.рф на 12.05.2020 г. проведено более более 5,8 миллионов тестов на наличие нового коронавируса. Цифра огромная. Однако, насколько достоверны результаты? Появляется все больше историй о типичной картине COVID-19 при отрицательных анализах. Почему так может происходить?

Сначала поговорим о ПЦР-тестах, которые специфически выявляют РНК вируса в пробах.

Взятие пробы для ПЦР

Показано, что для выявления нового коронавируса подходят смывы из носоглотки – из ротоглотки вероятность ложноотрицательного анализа немного выше [ 1 ]. Один из важнейших аспектов – время взятия материала. Проведенные исследования показывают, что при взятии материала у больного в первый день проявления симптомов COVID-19 положительный диагноз поставят с вероятностью 94 %, а вот к 10-му дню это будет всего лишь 67 %! [ 2 ].

Существует четкая закономерность: чем позже от возникновения симптомов взят материал, тем меньше шансов обнаружить в нем вирусную РНК.

Есть и хорошие новости: в течение первой недели от возникновения симптомов носоглоточные смывы имеют порядок от 100 000 до 1 000 000 копий вирусной РНК в 1 мл, что делает их легко обнаруживаемыми даже не самыми чувствительными системами. Исследования также показали, что вирусная нагрузка в верхних дыхательных путях может быть одинаковой у людей с проявленной симптоматикой и при бессимптомном течении болезни [ 3 ].

Транспортировка и хранение проб для ПЦР

Точность разных ПЦР-тест-систем

После попадания образцов в лабораторию правильность диагноза будет зависеть во многом от тест-системы, которую там используют. На сегодняшний день помимо двух тест-систем, разработанных еще в январе в ГНЦВБ «Вектор», зарегистрировано 8 ПЦР-тест систем [ 5 ]:

Из них системы «Вектора» и «Вектор-Беста» (последняя через сеть лабораторий «Инвитро» [ 6 ]) используются для исследования проб от государственных медицинских организаций. Здесь хочется отметить, что система «Вектора» не содержит в своем составе внутреннего контрольного образца, который должен добавляться во все пробы для контроля правильности выделения РНК и реакции обратной транскрипции [ 7 ]. Отсутствие такого контроля может также потенциально приводить к некоторому количеству ложноотрицательных результатов. Хорошая новость заключается в том, что остальные зарегистрированные тест-системы имеют в своем составе внутренний контроль, а также, по-видимому, обладают более высокой чувствительностью, т.е. дают меньше ложноотрицательных результатов.

Таким образом, в городах, где представлены сетевые лаборатории, есть возможность сдать анализ частным образом и надеяться на точность проведения процедуры. В первые дни появления симптоматики точность будет выше.

Экспресс-системы

Что касается экспресс-тест-систем, то есть опасения, что созданные в сжатые сроки «уникальные» тесты по своему качеству будут уступать системам, основанным на обычной ПЦР. Насколько надежны эти системы покажет время, однако уже сейчас количество ложноотрицательных результатов ПЦР в совокупности с длительностью ожидания результата привело к тому, что в клиниках страны диагноз стали ставить не на основе ПЦР-анализа, а на основе результатов компьютерной томографии (КТ).

КТ

Преимущество КТ-диагностики при наличии клинической картины – это скорость постановки диагноза и более высокая чувствительность по сравнению с реальностью ПЦР-диагностики: 97,2 % против 83,3 % согласно данным небольшого китайского исследования [ 12 ]. Начиная с 4-5 дня заболевания можно различить так называемый симптом «матового стекла», на стадии прогрессирования такие участки консолидируются, возникает симптом «булыжной мостовой», «обратного ореола», а в пиковая стадии – «белое легкое» [ 13 ]. Возникает закономерный вопрос: отличается ли картина пневмонии, вызванной именно новым коронавирусом, от заболеваний другой вирусной природы. Ответ – нет. Вирусные пневмонии, будь то аденовирус, грипп или другие респираторные вирусы, выглядят на КТ одинаково.

Однако в условиях пандемии, когда подавляющее большинство вирусных пневмоний имеют коронавирусную природу, использование КТ для диагностики становится более чем оправданным. В последней версии методических рекомендаций Минздрава по профилактике, диагностике и лечению COVID-19 указано, что «наличие клинических проявлений в сочетании с характерными изменениями в легких по данным КТ или обзорной рентгенографии органов грудной клетки вне зависимости от результатов однократного лабораторного исследования на наличие РНК SARS-CoV-2 и эпидемиологического анамнеза» является клинически подтвержденным случаем COVID-19 [ 14 ]. Отметим также, что объем поражения легких при РГ и КТ может не иметь прямой корреляции с клинической тяжестью заболевания.

ИФА (иммуноферментный анализ)

ПЦР-тест-системы, как и КТ-диагностика выявляет COVID-19 в острой фазе. Однако весьма актуальна и информация об уже переболевших, на основании которой можно судить об охвате населения заболеванием, а также о числе бессимптомных случаев. Ответы на эти, а также на многие другие вопросы, может дать тест-система на антитела. На сегодняшний день разработкой таких тест-систем помимо «Вектора» занимаются такие организации как «Вектор-Бест», «НПО «Диагностические системы», ФНКЦ ФХМ ФМБА России, «МБС-Технологии», а также «Генетико» и Институт молекулярной биологии РАН [5]. К сожалению, тест-системы на антитела требуют намного больших усилий и времени на разработку, чем ПЦР-системы, а их чувствительность и специфичность оставляет желать лучшего. Так, проведенное в США исследование доступных система на антитела показало, что лишь 3 из 14 систем дают надежные результаты (т.е. не более 1% ложноположительных результатов), но при этом их чувствительность не превышает 90% относительно положительных контрольных образцов [ 15 ]. Какова будет чувствительность и специфичность разрабатываемых российских систем – пока неизвестно.

Итак, самое разумное, что вы можете сказать клиентам:

Регистрируйся на нашем сайте и получай доступ ко в сем материалам о COVID-19 в специальном разделе.

Отвечаем на вопросы в прямых эфирах Вконтакте: https://vk.com/pharmznanie

Обсудить последние новости со всеми коллегами России вы можете в чатах:

Источник

ПЦР-диагностика Ковид-19

Пандемия коронавируса, охватившая весь мир, считается наиболее масштабной и опасной за всю историю человечества. Согласно последним данным, на начало декабря 2021 года общее число заболевших превышает 270 миллиона человек, из числа которых свыше 5,3 млн. погибших.

Врачи по всему миру прикладывают максимум усилий, направленных на предотвращение распространения инфекции, а также сокращение смертности среди населения.

Для наилучшей эффективности противоэпидемических мероприятий важно подобрать наиболее экономную и информативную систему тестирования, именно такой является ПЦР-диагностика.

Посредством выделения РНК вируса возможно обнаружить возбудитель в организме человека даже при его минимальной концентрации. Благодаря этому удается начать лечение заблаговременно, предотвратив прогрессирование Ковид-19 до тяжелых форм или убедиться в том, что человек полностью здоров. Сегодня такая возможность имеется и у пациентов нашей клиники.

Принцип проведения ПЦР-диагностики на Ковид-19

ПЦР или полимеразная цепная реакция – современный метод лабораторных исследований, который позволяет с предельной точностью выявлять различные инфекции в организме человека, включая Ковид-19. Результаты анализа максимально точны, исключается даже вариант ложноположительного теста. Однако в отношении COVID-19, в силу новизны и недостаточной изученности вируса, точность ПЦР-диагностики составляла в начале эпидемии порядка 80%. На сегодняшний день точность ПЦР-теста составляет 99.6%.

Суть метода заключается в обнаружении молекул РНК вируса во взятом биологическом материале. В отношении диагностики коронавируса исследуемым биоматериалом становится мазок слизистой ротоглотки и носоглотки.

Особое внимание при этом уделяется именно РНК SARS-CoV-2, то есть рибонуклеиновой кислоте, являющейся носителем генетической информации вируса. Но даже если при первом исследовании РНК вируса не выявлены, подозрения все же могут оставаться (что не связано с возможной погрешностью).

Как известно, инкубационный период в случае Ковид-19 составляет 14 дней, по этой причине полностью исключить болезнь удается после проведения повторной диагностики. При этом все же стоит отметить главное преимущество ПЦР-тестов – это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний. Это значит, что проведение даже единичного исследования с высокой долей вероятности даст точный результат и позволит определить, болен ли человек на момент забора биоматериала.

Специфика анализа РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19)

Анализ на РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) можно назвать стандартный ПЦР-тест на коронавирус. В данном случае выполнение исследования занимает 1 день с момента забора биоматериала. В случае положительного результата исследования человек считается инфицированным. Если же РНК коронавируса не выявлена, тест отрицателен, можно с уверенностью говорить о том, что человек не является носителем вируса.

Специфика анализа РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) (CITO)

РНК SARS-CoV-2 (КОВИД, COVID-19) (CITO) – схожее по принципу забора биоматериала и методу проведения исследование. Разница заключается лишь в скорости, припиской «CITO» обозначается экспресс-тест, который, в отличие от стандартного метода исследования, проводится в течение нескольких часов. Несмотря на то, что результат будет готов уже спустя 3-4 часа, это не влияет на показатели точности, но такой вариант диагностики обходится дороже.

Особенности забора биоматериала

Процесс забора биоматериала – важнейший этап в ПЦР-диагностике. Крайне важно получить чистый образец, ведь от этого зависит точность и результативность исследования. К счастью, для проведения ПЦР-тестов на Ковид процесс взятия мазка из носоглотки и ротоглотки предельно прост и не требует предварительной подготовки со стороны пациента:

Экспресс-тест NowCheck COVID-19 AG – набор исследований для максимально быстрой и простой диагностики новой коронавирусной инфекции. Тест позволяет выявить антигены COVID-19 в слизи из носоглотки методом ИХА (иммунохроматографии). По точности и достоверности он приближен к анализу ПЦР, но в отличие от него не требует специальных условий и оборудования.

Тест зарегистрирован в реестре медицинских изделий и имеет медицинское регистрационное удостоверение РФ. Метод, который лежит в основе исследования, получил одобрение Министерства здравоохранения России.

Диагностика занимает в среднем 15-30 минут, что позволяет максимально быстро заподозрить коронавирусную инфекцию и принять решение о госпитализации.

Показания к проведению исследования

ПЦР-диагностика коронавируса с предельно высокой на сегодняшний день точностью позволяет получить ответ на конкретный вопрос – болеет ли человек коронавирусом в данным момент. Это исследование не позволяет узнать, переболели вы ранее или нет.

Таким образом, учитывая текущие карантинные меры во многих странах, данный метод диагностики особенно актуален для людей, которые собираются поехать за границу или возвращаются домой.

В таких реалиях показаниями к проведению ПЦР теста являются:

Сертификация

Лаборатория, проводящая данное исследование обладает всеми необходимыми сертификатами для проведения ПЦР-диагностики на COVID-19 (коронавирус). Лабораторные исследования проводятся согласно международным стандартам на современном диагностическом оборудовании.

Заключение о проведенном исследовании выдается пациенту на специальном бланке с печатями, подтверждающими действительность документа.

Источник

Что такое ПЦР-тест на коронавирус

ПЦР-тест отличается высокой точностью, с его помощью в биологических материалах определяются разные чужеродные микробы. Например, бактерии, грибки, вирусы. Для проведения лабораторных исследований подойдут пробы слюны, мочи, сыворотки крови, разных жидкостей организма. Ведь именно в них присутствуют патогены. Для обработки образцов применяют химические реагенты. Они провоцируют выделение фрагментов геноме возбудителей. После количество нуклеиновых кислот увеличивается, это происходит благодаря воздействию слабых электродов, амплификации ферментом полимеразой. При увеличении их количества такие кислоты будет проще увидеть на специальном компьютерном оборудовании.

Для начала надо разобраться, что такое ПЦР-тест на коронавирус. ПЦР-тесты известны своей высокой чувствительностью, благодаря этому обеспечивается точный результат. Это актуально даже для тех ситуаций, когда в организме человека содержится немного инфекционных частиц и нет никакой симптоматики. Этот анализ делают, чтобы понять, болеет ли человек коронавирусом или нет. Но ПЦР-тест не может узнать стадию болезни, насколько давно был контакт с больным человеком. Это могут подсказать уже другие методы диагностики.

Особенности теста

Такой вирус, как SARS-CoV-2, проходит через рот, глаза, нос и таким образом достигает человеческого организма. С помощью специфичных шипов он цепляется клеток и фиксируется на мембранах. Чаще всего поражаются данным вирусом ткани систем пищеварения, мочевыделения, дыхания, ЦНС, также страдает сердце.

Как только человек заразился вирусом SARS-CoV-2, на протяжении первых нескольких дней он размножается непосредственно в эпителии носоглотки, причем делает это активно. Инфекция находиться в слюне, секрете, которое отделяется. Распространение инфекции между окружающими происходит во время глубокого дыхания, кашля, чихания больного человека. Последний может и сам не подозревать о болезни. Даже при отсутствии симптомов человек будет опасным и заразным. В большинстве случаев коронавирус напоминает стандартное ОРВИ, который не обладает какими-то особыми проявлениями. Чтобы определить, попал ли новый патоген в организм, стоит сделать ПЦР-тест.

Коронавирусы не циркулируют в лимфе, крови. Поэтому и анализ делают с носоглотки, ее слизистых оболочек. Медики утверждают, что у пациентов, у которых диагностируют манифестное либо бессимптомное течение болезни, есть вероятность, что результаты теста будут ложными. Возбудитель не будет долго оставаться на эпителии. Поэтому рекомендуется проводить анализ несколько раз. Если у человека долгое время не могут выявить коронавирус, можно сдать другой анализ – на антитела. Для этого используют метод ИФА.

Кто должен сделать тест?

Существуют определенные категории людей, которым очень нужно провести тест на коронавирус:

Вышеупомянутым группам людей должны делать анализы в рамках ОМС. Если другие люди захотят исследоваться и проверить, есть ли у них коронавирсу, то они могут выполнить нужный анализ, но он будет платным. Все тестовые системы, которые понадобятся для исследований, изготавливают в научно-исследовательских институтах, которые обладают специальной государственной лицензией.

Как правильно проводиться тест?

Важно подготовиться к тому, когда будут брать биоматериал для исследований. Иначе возрастает риск получить ложный результат. За сутки до анализа нельзя употреблять алкоголь и принимать антимикробные препараты.

Непосредственно перед самим анализом (за 2 часа) нельзя курить, чистить зубы, кушать леденцы, освежающие дыхание, пить воду, напитки, употреблять пищу. Также специалисты не рекомендуют пользоваться ингаляторами, назальными препаратами, полоскать рот или жевать жвачку.

Мазок берут из зева человека. При желании весь набор для диагностики курьер может доставить на дом больному, при этом все выполняется бесконтактно. Аппликатором, который расположен на конце стерильного тампона, проводят по слизистой. После материал кладут в герметичный пакет, после чего отправляют на исследование в лабораторию.

Возбудитель коронавируса относится к РНК-вирусам. Геном, который обнаруживают у человека, во время тестирования переводят в ДНК. А позже он обратно превращается в РНК.

Если говорить о полном цикле анализа, то результаты можно получить спустя 2-4 дня. Существует экспресс-диагностика, с результатами которой можно ознакомиться уже через 1 час. Однако такой тест будет иметь большую погрешность. Подобные данные считают предварительными, которые обязательно нужно повторно проверить.

Источник

Экспресс-диагностика новой коронавирусной инфекции с помощью реакции петлевой изотермической амплификации

Полный текст:

Аннотация

В настоящем обзоре представлены основные принципы применения реакции петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) для экспресс-диагностики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2. Кратко описаны базовые технические детали метода, наиболее популярные способы специфической и неспецифической детекции продуктов амплификации, обсуждены первые опубликованные работы по использованию рассматриваемой технологии для выявления фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты вируса SARS-CoV-2, в том числе разрабатываемые в Российской Федерации. Для доступных тестов на базе LAMP перечислены основные аналитические характеристики наборов, которые нередко сравнимы с параметрами тест-систем на основе метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а в ряде случаев превосходят их. Обсуждены преимущества и ограничения этого подхода в сравнении с другими способами молекулярной диагностики (в первую очередь ОТ-ПЦР), а также перспективы развития технологии для выявления возбудителей других инфекций.

Ключевые слова

Для цитирования:

Хафизов К.Ф., Петров В.В., Красовитов К.В., Золкина М.В., Акимкин В.Г. Экспресс-диагностика новой коронавирусной инфекции с помощью реакции петлевой изотермической амплификации. Вопросы вирусологии. 2021;66(1):17-28. https://doi.org/10.36233/0507-4088-42

For citation:

Khafizov K.F., Petrov V.V., Krasovitov K.V., Zolkina M.V., Akimkin V.G. Rapid diagnostics of novel coronavirus infection by loop-mediated isothermal amplification. Problems of Virology. 2021;66(1):17-28. https://doi.org/10.36233/0507-4088-42

1. Введение

В декабре 2019 г. в Ухане (Китайская Народная Республика, КНР) произошла вспышка нового заболевания, вызванного вирусом, получившим впоследствии наименование «коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома 2» (Severe Acute Respiratory Syndrome CoV 2, SARS-CoV-2, 2019-nCoV). Этот возбудитель вызывает так называемую «новую» коронавирусную инфекцию (novel Coronavirus Disease 2019, COVID-19) – болезнь, характер распространения которой с марта 2020 г. классифицируется Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как пандемия (https://www.who.int/ru/director-general/speeches/detail/who-director-general-sopening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19—11-march-2020). Вирус SARS-CoV-2 относится к роду Betacoronavirus семейства Coronaviridae, представители которого поражают в основном млекопитающих [1]. Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной почти 30 тыс. нуклеотидных пар (н.п.) оснований с 14 открытыми рамками считывания, кодирующими 27 белков [2]. Симптомы инфекции сходны с проявлениями некоторых других респираторных заболеваний, но у значительной доли пациентов болезнь может протекать бессимптомно в течениедостаточно продолжительного времени [3]. Поэтому отслеживание распространения нового патогена – крайне сложная задача, особенно с учётом того, что он достаточно легко передаётся от больного незаражённым. По состоянию на январь 2021 г. согласно данным Ресурсного Центра по коронавирусу им. Джона Хопкинса (John Hopkins Coronavirus Resource Center, https://coronavirus.jhu.edu/) зарегистрировано свыше 100 млн подтверждённых случаев COVID-19 и более 2 млн смертей, что свидетельствует о скорости распространения вируса и важности мер по его сдерживанию. Поскольку в настоящее время средств для эффективного лечения новой коронавирусной инфекции не существует, а массовая вакцинация в разных странах находится на начальной стадии и длительность сохранения приобретённого иммунитета достоверно неизвестна, имеется острая необходимость в чувствительном и по возможности недорогом методе экспресс-диагностики с хорошей воспроизводимостью результатов. Для решения этой проблемы желательно иметь быстрый, простой и одновременно эффективный в эксплуатации набор для тестирования. С помощью подобного теста инфицированные пациенты могут быть идентифицированы на ранней стадии, что позволит ограничить социальные контакты и усилить врачебный контроль за их состоянием, в то время как здоровые люди смогут продолжать вести обычную жизнь.

Основой молекулярной диагностики инфекции, вызванной SARS-CoV-2, в настоящее время является применение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [4, 5]. Такое исследование обнаруживает присутствие вирусных нуклеиновых кислот в образцах мазков из носоглотки с очень высокими показателями чувствительности и специфичности. ВОЗ и Центры по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) одобрили тесты на основе ОТ-ПЦР в качестве «золотого стандарта» для обнаружения возбудителя COVID-19 [6–8]. В Российской Федерации Росздравнадзором на данный момент зарегистрировано более 40 тест-систем отечественных производителей на основе ПЦР. Однако при всех очевидных преимуществах у данного способа есть несколько недостатков. В частности, реакция ОТ-ПЦР требует дорогостоящего лабораторного оборудования: цена большинства амплификаторов с возможностью детекции в реальном времени превышает 2 млн руб., что ограничивает их использование в небольших диагностических учреждениях. Кроме того, для проведения исследования требуется квалифицированный персонал, а вся процедура тестирования занимает несколько часов без учёта времени доставки биоматериала в лабораторию. Эти ограничения усугубляются стремительным распространением пандемии, поскольку ОТ-ПЦР не предполагает возможности быстрого и массового скрининга на местах [9]. Другие широко используемые методы диагностики COVID-19 – серологические тесты, которые выявляют антитела или антигены, ассоциированные с коронавирусной инфекцией. Они просты в применении, дают быстрые результаты и при этом не требуют существенных затрат. Однако такие системы не обладают достаточной точностью, чтобы быть надёжным подспорьем в выявлении SARS-CoV-2 из-за низкой чувствительности и невысокой специфичности (https://open.fda.gov/apis/device/covid19serology/). Кроме того, подобные тесты практически бесполезны на самых ранних стадиях болезни [10], когда исключительно важно выявить и изолировать одного или нескольких больных во избежание массового заражения. Наконец, разработки диагностикумов на основе технологий высокопроизводительного секвенирования [11], потенциально способных выявлять все известные вирусные патогены и потому крайне востребованных во время вспышек инфекционных заболеваний неясной этиологии, пока находятся в начальной стадии и не могут быть использованы на практике во время пандемий.

Таким образом, имеется насущная необходимость в новых эффективных решениях для диагностики новой коронавирусной инфекции. Один из подходов – группа технологий на основе изотермической амплификации, такие как амплификация по принципу «катящегося кольца» (Rolling Circle Replication, RCA) [12], реакция транскрипционной амплификации (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA) [13], рекомбиназная полимеразная амплификация (Recombinase Polymerase Amplification, RPA) [14], хеликазозависимая (Helicase-Dependent DNA Amplification, HDA) [15] и петлевая изотермическая амплификация (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) [16]. Последняя вполне обоснованно считается наиболее перспективной разновидностью изотермической амплификации, что отражено в наиболее частом её упоминании в научных публикациях по сравнению с остальными. Технология LAMP похожа на обычные методики на основе ПЦР за исключением того, что амплификационный процесс протекает при постоянной температуре, что в принципе позволяет отказаться от использования дорогостоящего термоциклера, заменив его обычным термостатом. Такой способ амплификации делает выявление ДНК/РНК возбудителя в клиническом материале более быстрым и простым в использовании по сравнению с тестами на основе ПЦР, что подробно обсуждено, в частности, в недавнем обзоре [17]. Другие преимущества LAMP включают широкий диапазон доступных значений pH и температуры, которые являются приемлемыми для экспериментов [18], теоретическую возможность использовать образцы без этапа выделения нуклеиновых кислот [19] и гибкость процедур детекции получаемого продукта при сохранении специфичности и чувствительности, примерно равных таковым у ПЦР-систем или иногда даже превосходящих их [20, 21]. Например, специфичность тестов на базе LAMP может быть во много раз выше, чем в случае ПЦР, так как необходимость одновременного отжига на матрице ДНК сразу нескольких пар праймеров в нужном порядке (см. ниже детальное описание метода) обусловливает исключительно низкую вероятность случайной амплификации нецелевого фрагмента генома.

Настоящий обзор имеет целью представить описание базовых принципов обнаружения нуклеиновых кислот с помощью петлевой изотермической амплификации и обобщение различных технологий метода, которые были разработаны для использования в диагностике COVID-19. По мнению авторов, он сможет предоставить общую информацию исследователям, заинтересованным в создании основанных на принципе LAMP методик обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов, а также дать более чёткое представление о потенциале использования рассматриваемой разновидности амплификации в процессе контроля текущей пандемии и потенциальных угроз в будущем.

2. Описание метода петлевой изотермической амплификации (LAMP)

LAMP – метод амплификации нуклеиновых кислот, известный с 2000 г. [16], который в настоящее время занимает всё большее место в диагностике инфекционных заболеваний, что во многом вызвано пандемией COVID-19 и необходимостью масштабного скрининга населения в максимально сжатые сроки. Этот процесс происходит при постоянной температуре (обычно 60–65 °C), что исключает необходимость использования термоциклера (как в случае традиционной ПЦР); кроме того, реакция устойчива к действию многих ингибиторов ПЦР [18]. Первоначально для амплификации целевой последовательности генома применяли 4 праймера [16], позже технология была оптимизирована с помощью введения дополнительной их пары [22]. Для протекания реакции достаточно присутствия в смеси единственного фермента – ДНК-полимеразы, обладающей способностью вытеснять цепь ДНК (например, Bst-полимераза из бактерии Geobacillus stearothermophilus или Bsm-полимераза из Bacillus smithii).

Как показано на рисунке, используемый для проведения типичного эксперимента с помощью LAMP набор состоит из 2 внешних (F3 и B3) и 2 внутренних (FIP и BIP) праймеров, которые распознают 6 отдельных областей последовательности ДНК-мишени (F3c, B3c, F2c, B2c, F1 и B1). Прямой внутренний праймер (FIP – Forward Internal Primer) в направлении 5’→3’ состоит из области F1c, комплементарной последовательности мишени F1, и области F2, которая комплементарна участку F2c. Аналогично обратный внутренний праймер (BIP – Backward Internal Primer) состоит из областей B1c и B2, комплементарных последовательностям B1 и B2c в ДНК-мишени. Внешние праймеры F3 и B3 имеют последовательности, комплементарные участкам F3c и B3c соответственно. Применяемые для любой процедуры LAMP праймеры должны быть оптимизированы в целях удовлетворения ряду критериев, таких как температура плавления, GC-состав, длина и расстояния между участками в ДНК-мишени, стабильность 5’- и 3’-концов и т.д. [23].

Амплификационный процесс начинается с формирования комплекса FIP с целевой ДНК в области F2 с образованием двухцепочечной ДНК в равновесии при температуре около 65 °C [23]. Затем Bst-ДНК-полимераза с вытесняющей активностью инициирует соединение ДНК с FIP, одновременно вытесняя одну цепь ДНК при её наличии. После этой стадии инициации праймер F3 связывается с комплементарной областью F3c и замещает созданную FIP-комплементарную цепь. Благодаря наличию последовательности F1c в FIP последняя способна самоотжигаться и образовывать петлевую структуру на одном конце ДНК. Эта цепь затем служит мишенью для инициированного c BIP синтеза ДНК и последующего замещения цепи из процесса образования молекулы нуклеиновой кислоты, начавшегося с B3. Подобное явление позволяет другому концу одноцепочечной ДНК также образовывать форму петли, в результате чего получается напоминающая гантель структура, служащая шаблоном для последующей амплификации. Полезными для первичного понимания механизма LAMP могут быть соответствующие видеоролики от компании – крупного производителя Bst-полимеразы «New England Biolabs» (США) (https://youtu.be/9Kv_hSDEX7M; https://youtu.be/cnXDTjCXGjE). Для дизайна структур праймеров часто используют специализированный программный продукт PrimerExplorer (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). Важным нюансом в ходе разработки является отсутствие гомои гетеродимеров, поскольку они способны ингибировать образование целевого продукта в ходе нематричной амплификации, приводя к ложным результатам.

После образования гантелеподобной структуры происходит экспоненциальная амплификация аналогичных образований, при этом ДНК-полимераза запускает синтез ДНК в области F1. FIP также гибридизуется с однопетлевой структурой из участка F2, и синтез ДНК этого праймера вызывает смещение праймированной с области F1 цепи и самосвязывание её в петлевую структуру. Наконец, с другой стороны исследуемого фрагмента ДНК, из области B1 в новой петле повторно начинается синтез самопраймированной ДНК с амплификацией текущей матрицы и созданием новой из замещения FIP-комплементарной цепи. Благодаря этому повторяющемуся процессу возможно получение больших количеств нуклеиновых кислот – ДНК может быть амплифицирована до 10 9 раз в течение 1 ч [24]. Для дальнейшего повышения эффективности разработана также методика LAMP с 6 праймерами (т.н. петлевыми) [22]. В ней вместо 2 пар используются 3, при этом прямые и обратные петлевые праймеры (LoopF и LoopB) отжигаются с областями между F1/F2 и B1/B2 соответственно [23]. Доказано, что такие праймеры ускоряют течение реакции, поскольку амплификация происходит быстрее благодаря увеличению количества начальных точек синтеза ДНК [24].

С целью расширения возможностей LAMP от определения ДНК до выявления РНК, а также
для реализации мультиплексной детекции в исходный протокол было добавлено несколько улучшений для разработки различных методик, включая процедуру LAMP с обратной транскрипцией (RT-LAMP) и мультиплексную LAMP. В первом случае к реакционной смеси добавляют обратную транскриптазу, чтобы осуществить преобразование вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК), которая будет затем использована для амплификации. Эта процедура оказалась важнейшей в идентификации множества РНК-вирусов [24], в том числе и SARS-CoV-2. Так, комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК разработки ФБУН ЦНИИ эпидемиологии по состоянию на 2020 г. входил в состав более 25% наборов для диагностики новой коронавирусной инфекции в РФ. Мультиплексные системы на базе LAMP были разработаны для обнаружения нескольких патогенов в одной пробирке с использованием большего числа праймеров либо с уникальными флуоресцентными сигналами [25, 26]. Вышеперечисленные характеристики тестов на основе LAMP свидетельствуют о перспективности рассматриваемой технологии в области экспресс диагностики вирусных инфекций. Таким образом, данный метод имеет большой потенциал для выявления SARS-CoV-2, о чем сказано далее в соответствующем разделе.

3. Детекция продуктов амплификации LAMP

3.1. Неспецифические методы детекции

В ходе LAMP-амплификации происходит накопление пирофосфата, высвобождающегося при синтезе молекул ДНК вследствие гидролиза нуклеозидтрифосфатов. Он, в свою очередь, взаимодействует с присутствующими в буфере ионами магния (Mg 2+ ), благодаря чему образуется белый осадок. В результате в ходе реакции происходит помутнение раствора, которое может быть зафиксировано, например, посредством турбидиметра (мутномера) [27]. Ещё одним часто используемым способом неспецифической детекции служит добавление в реакционную смесь интеркалирующих красителей, в частности SYBR™ Green I, EvaGreen™ или SYTO, что позволяет с помощью ПЦР амплификатора с детекцией в режиме реального времени получать кривые амплификации. Однако недостатком ряда (хотя и не всех) этих красителей является их ингибирующий реакцию эффект, что может снижать чувствительность тестов на основе LAMP [28]. В то же время показано, что метод LAMP толерантен к веществам, ингибирующим ПЦР, что является его важным преимуществом [18]. При использовании некоторых красителей (например, SYBR™ Green I или EvaGreen™) пробирки можно освещать ультрафиолетовой (УФ) лампой или светодиодом, что даёт окрашивание положительных проб [29].

Помимо этого для возможности использования в полевых условиях разработан ряд методик для визуализации конечных продуктов невооружённым глазом. Обычно к реакционной смеси добавляют индикаторы, меняющие цвет в случае прохождения реакции. Для некоторых из них (включая, крезоловый красный или нейтральный красный) необходимо довести рН исходной реакционной смеси до определённого значения (

8,8). В ходе реакции этот показатель снижается до

6,0–6,5, что сопровождается изменением цвета красителя [30]. Другие индикаторы не требуют специальной подготовки смеси: например, гидронафтол синий или флуоресцентный краситель Quant-iT™ PicoGreen™, изменение цвета которых также можно наблюдать невооружённым глазом [31]. Предложен также простой метод детекции, основанный на гель-электрофорезе [32]. Кроме того, результат амплификации можно количественно оценить посредством измерения концентрации ионов марганца (Mn 2+ ). Для этого было предложено перед реакцией добавлять к раствору кальцеин (флуорексон) – индикатор флуоресцентного металла, в отсутствие свободных Mn 2+ начинающий флуоресцировать при облучении светом с определённой длиной волны (495 нм) [33]. Если же в начальной смеси присутствовали указанные ионы, то кальцеин будет образовывать с ними нерастворимый солевой комплекс марганец– пирофосфат. Впоследствии флуоресценция ещё более усиливается при связывании свободного кальцеина с Mg 2+ из реакционной смеси LAMP, и её можно легко наблюдать в УФ-свете при длине волны 365 нм [24]. Наконец, среди других неспецифических способов можно отметить анализ кривых плавления и отжига, биолюминесценцию через конверсию пирофосфата [34] и электрохемилюминесценцию [35].

Следует отметить, что хотя вероятность случайной амплификации похожих последовательностей геномных фрагментов, принадлежащих другим организмам, достаточно мала и в значительной степени может контролироваться за счёт тщательного дизайна праймеров, перечисленные выше методы обнаружения, не зависящие от последовательностей ДНК, могут показать наличие длинных димеров праймеров как ложноположительный результат [36]. В связи с этим возникает проблема специфической (зависящей от последовательности нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность-специфичной) детекции продуктов амплификации LAMP. Ряд таких методик описан в следующем разделе.

3.2. Специфические методы детекции

На сегодняшний день опубликовано более 30 различных методов детекции продуктов амплификации ДНК при помощи LAMP, которые детально разобраны в недавнем обзоре [37]. Здесь мы кратко представляем лишь наиболее перспективные на наш взгляд для практической диагностики COVID-19.

3.2.1. Молекулярный маяк

ДНК-зонд, специфичный к фрагменту мишени, модифицируется флуорофором и гасителем с каждого конца. При этом его 5’-конец комплементарен 3’-концу на протяжении 5–7 нуклеотидов, что позволяет формироваться структуре в форме шпильки или «сковородки» [38, 39]. В отсутствие амплификационных продуктов молекулярный маяк (molecular beacon) существует в форме замкнутой петли из-за внутримолекулярной гибридизации между фрагментами у 5’- и 3’-концов. Таким образом, флуорофор и гаситель располагаются в непосредственной близости, что приводит к затуханию флуоресценции. При наличии продуктов амплификации зонд специфически гибридизуется с ампликоном, в результате чего петля раскрывается, разделяя флуорофор и гаситель с последующим высвобождением флуоресценции. Молекулярные маяки применялись ранее с целью определения вирусных нуклеиновых кислот при помощи LAMP для вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ; Human Immunodeficiency Virus, HIV), гепатитов B, C и E (Hepatitis Virus type B, C, E – HBV, HCV, HEV), Денге (Dengue Virus, DENV) и Западного Нила (West Nile Virus, WNV) [38]. Аналитическая чувствительность при этом составила 50–100 вирусных частиц на реакцию в случае обнаружения вирусов гепатита B и C. Высокая аналитическая специфичность подтверждена тестированием на различных вирусных нуклеиновых кислотах. Кроме того, проведены клинические испытания на реальном биологическом материале от пациентов. Итоговые показатели диагностической чувствительности и специфичности достигли 97 и 100% соответственно. Молекулярные маяки были также использованы для обнаружения части гена ompW длиной 1031 п.н. из Vibrio cholerae [39]. Необходимо отметить нестабильность шпилек в условиях реакции LAMP, что иногда приводит к не очень высокому соотношению сигнал/шум. С помощью «заблокированных» нуклеиновых кислот (Locked Nucleic Acids, LNA), создающих более высокие температуры плавления, можно повысить термостабильность молекулярных маяков, уменьшая сигнал фоновой флуоресценции [40].

3.2.2. Конкурентно-связывающийся тушащий зонд

Конкурентно-связывающийся тушащий зонд для LAMP (Alternately Binding Quenching Probe Competitive LAMP, ABC-LAMP), разработанный первоначально в целях количественного определения ДНК, использует гуаниновое тушение и основан на конкурентной гибридизации [41]. Реакционная смесь включает 2 мишени: целевой ампликон и внутренний контроль амплификации (так называемый «конкурент»). Обе они содержат одинаковую последовательность в области петли, которая комплементарна особому флуоресцентно-меченному (ФМ)-зонду для альтернативного тушения за счёт связывания (Alternately Binding Quenching Probe, AB-QProbe). При этом связывание зонда с целевым ампликоном снижает интенсивность флуоресценции вследствие её тушения гуанином. Напротив, связывание с конкурентом поддерживает флуоресценцию метки зонда, так как гуанин в конкуренте заменён на цитозин. Отношение числа продуктов амплификации от мишени и от конкурента можно рассчитать по интенсивности флуоресценции. Процедура ABC-LAMP охарактеризована для модельной мишени – гена amoA, который кодирует фермент, окисляющий аммиак у бактерий окружающей среды. Аналитические параметры не оценивались, однако успешно продемонстрировано точное количественное определение. Преимущество ABC-LAMP для количественного определения ДНК-мишени состоит в том, что присутствующие в смеси для LAMP ингибиторы одинаково влияют на амплификацию реальной мишени и конкурента. Последний при этом служит внутренним контролем и позволяет количественно определять амплификационные продукты на основе измерений флуоресценции в начале и в конце процесса амплификации, не требуя мониторинга в режиме реального времени. Одним из недостатков подхода является то, что эффективность усиления флуоресценции мишени и конкурента должна быть сбалансирована, для чего необходимо построение стандартной кривой.

3.2.3. Флуоресценция петлевого праймера при самозатухании

Внутренний или петлевой праймер могут быть модифицированы флуорофором (в позициях 2 или 3 тимина с 3’-конца), способным к самозатуханию. Этот процесс является механизмом гашения, не основанном на FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer – флуоресцентный резонансный перенос энергии), так как не требуется дополнительных флуорогенных молекул. Детали повторного появления ранее погашенной флуоресценции сопряжённой метки пока окончательно не ясны, но одно из возможных объяснений гашения флуоресценции может заключаться в донорской способности гуанина, которая позволяет переносить заряд между азотистым основанием и ближайшим красителем [42]. Первоначально модифицированный флуорофором праймер не связан с матрицей ДНК и находится в растворе в свободном состоянии, вследствие чего может проявлять феномен самозатухания. Во время амплификации такой праймер включается в двухцепочечный ампликон, что ведёт к ослаблению тушения и, как следствие, усилению флуоресценции. По мере увеличения числа подобных ампликонов интенсивность свечения нарастает, что свидетельствует об успешной амплификации с помощью реакции LAMP. Аналитическая и клиническая валидация методики с использованием флуоресценции петлевого праймера при самозатухании (Fluorescence of Loop Primer Upon Self Dequenching, FLOS-LAMP) проведена в отношении высокоинфекционного для человека ДНК-содержащего вируса ветряной оспы Varicella zoster [43]. В эксперименте использовались 2 типа материала: без этапа предварительной экстракции нуклеиновых кислот и на уже выделенной ДНК, причём в последнем варианте наблюдался более надёжный сигнал. Аналитическая чувствительность составила 500 копий на реакцию, показатели диагностической чувствительности и специфичности – 96,8 и 100% соответственно. Одной из технических проблем в рассматриваемом случае является необходимость подбора флуорофоров, демонстрирующих высокое самозатухание, и праймера, подходящего для модификации флуорофором в нужном месте, что не всегда представляет собой простую задачу и накладывает определённые ограничения при дизайне структур олигонуклеотидов. Визуализация при таком способе возможна также при добавлении полиэтиленимина, что приводит к образованию его нерастворимого комплекса с ампликоном. Флуоресцентно-меченные зонды встраиваются в осадок и могут быть обнаружены при помощи обычной УФ-лампы. Кроме того, существует принципиальная возможность различения 2 мишеней с получением, таким образом, аналогичного мультиплексу формата при присутствии в смеси лишь одной из них.

3.2.4. Универсальный ФМ-зонд

Универсальный ФМ-зонд (QProbe) [44] используется совместно с присоединённой одноцепочечной молекулой ДНК, которая состоит из комплементарной ДНК-мишени последовательности одного из основных праймеров с добавленной 5’-концевой универсальной последовательностью, комплементарной в свою очередь универсальному олигонуклеотиду с присоединённым гасителем на 3’-конце. Такая молекула ДНК действует как сочленение между ФМ-зондом и мишенью посредством гибридизации с матрицей во время амплификации. Перенос электрона между флуорофором и гуанином в целевой последовательности вызывает тушение флуоресценции. Преимущество метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность зонда фиксирована и не содержит целевых (вариабельных) областей; кроме того, возможно использование внутреннего контроля. Тем не менее этот способ является последовательность-специфичным механизмом детекции продуктов амплификации, поскольку флуорофор, прикреплённый к 3’-концу универсальной последовательности, тушится гуанином в целевой цепи при условии нахождения последнего в непосредственной близости. Указанная методика применима лишь в ситуациях, когда основания гуанина присутствуют в целевой последовательности в нужной позиции, в связи с чем её можно в большей степени считать полууниверсальной.

3.2.5. Зонды LightCycler

Зонды LightCycler были использованы в процессе реакции LAMP Chou P.H. и соавт. [36] и в настоящее время коммерчески доступны для ПЦР. Конструкция содержит зонд-акцептор, модифицированный гасителем на 5’-конце, и зонд-донор с флуорофором на 3’-конце. Расстояние между 5’- и 3’-концами акцепторной и донорной частей в целевой последовательности обычно равно 2 н.п., что позволяет гарантировать близость расположения флуорофора и гасителя. В процессе LAMP генерируются ампликоны, обеспечивающие комплементарные зондам последовательности, с которыми они гибридизуются, приближая флуорофор и гаситель. Аналитическая чувствительность определялась для вируса синдрома белых пятен (White Spot Syndrome Virus, WSSV) креветок пенеид (Penaeidae) и оказалась равной около 100 копий на реакцию. Специфичность подтверждена тестированием на ДНК хозяина и других обнаруженных у креветок вирусных патогенов. Клиническая значимость продемонстрирована путём тестирования геномной ДНК вируса WSSV при инфицировании им белоногой креветки (Penaeus vannamei) [36].

3.2.6. Детекция на основе нуклеазы Cas12 и тонкослойной хроматографии

Broughton J.P. и соавт. [8] опубликовали разработку и первоначальную валидацию теста для обнаружения РНК SARS-CoV-2 из образцов пациентов на основе комплекса CRISPR/Cas12. Методика получила название DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter). В ходе такого исследования одновременно осуществляются обратная транскрипция и изотермическая амплификация по методу RT-LAMP, а также последующее обнаружение с помощью белка Cas12 предопределённых последовательностей нового коронавируса, после чего расщепление репортёрной молекулы подтверждает выявление вирусной РНК. Визуализация детекции Cas12 достигается с помощью молекулы FAM-биотина и тест-полосок, предназначенных для захвата меченых нуклеиновых кислот. Нерасщеплённые репортёрные молекулы при этом захватываются на 1-й (контрольной) линии детектирования, тогда как неизбирательная активность расщепления Cas12 генерирует сигнал на 2-й (тестовой) линии.

3.3. Другие методы детекции

Безусловно, на этом список методик специфической детекции продуктов амплификации с помощью LAMP не исчерпывается, однако их подробное описание выходит за рамки данного обзора. Среди других возможных способов можно упомянуть гашение гуанином с потерей сигнала при отжиге праймера [45], флуоресценцию с усилением сигнала с использованием меченых праймеров и интеркалятора – бромида этидия (C₂₁H₂₀BrN ) [46], обнаружение амплификации по высвобождению тушения (Detection of Amplification by Release of Quenching, DARQ) [47], использование ассимилирующего зонда [48], метод одноступенчатого вытеснения цепи (One-step Strand Displacement, OSD) [49].

4. Недостатки метода LAMP

Одним из основных недостатков тестов на базе LAMP является относительная сложность дизайна праймеров, так как требуется подобрать сразу 6–8 участков на достаточно коротком фрагменте ДНК и избежать при этом амплифицирования других (нежелательных) её последовательностей, особенно в геноме хозяина, что существенно ограничивает выбор целевых участков. Большое количество праймеров увеличивает также вероятность формирования конкатамеров [50]. В связи с тем что суммарная область покрытия праймерами существенно больше, чем при классической ПЦР, заметно выше становится и вероятность появления мутаций в местах посадки, особенно у РНК-вирусов, к которым относится и SARS-CoV-2. Это явление может привести к меньшей эффективности отжига праймеров с получением ложнонегативных результатов [51]. Поэтому необходимо постоянно отслеживать появление новых мутационных изменений в геномах исследуемых патогенов, чтобы своевременно корректировать ситуацию посредством замены олигонуклеотидов либо введением так называемых вырождений. Кроме того, возможно одновременное использование сразу 2 и более геномных фрагментов в одном тесте, особенно при неспецифической детекции продукта амплификации, что может снизить эффект появления замен в геноме и предоставить дополнительное время на редизайн праймеров в случае необходимости.

Другая проблема, частично описанная выше, – трудности в специфической детекции амплификационных продуктов, хотя для их преодоления предложены различные подходы (см. раздел 3) [37]. Таким образом, LAMP пока проблематично использовать в режиме мультиплекса для выявления сразу нескольких патогенов в одной пробирке, что важно при диагностике острых респираторных и кишечных инфекций, вызываемых большим количеством бактерий и вирусов. Кроме того, этот факт определённым образом усложняет процесс внесения внутреннего контрольного образца (ВКО), которое постепенно становится практически обязательным этапом в подготовке коммерческих диагностических тест-систем.

Наконец, следует отметить сохраняющуюся ограниченность в предложении на российском рынке реагентов отечественного производства для реакции петлевой изотермической амплификации (в частности, Bst-полимеразы), хотя указанная ситуация, несомненно, будет улучшаться.

5. Прогресс в обнаружении SARS-CoV-2 с помощью RT-LAMP

В самом начале пандемии COVID-19 (2020 г.) Lamb L.E. и соавт. [21] сообщили о разработке скринингового экспресс-теста на основе LAMP для обнаружения РНК SARS-CoV-2 с продолжительностью анализа менее 30 мин без этапа выделения. Для достижения этой цели были использованы консенсусные последовательности 23 известных на тот момент штаммов вируса. С помощью программного обеспечения LAMP Designer (Premier Biosoft™, США) был осуществлён дизайн праймеров для таргетирования консенсусных последовательностей в ходе RT-LAMP, общих для всех известных штаммов коронавируса, но отличающихся от таковых у вирусов со схожими последовательностями (например, коронавирус летучих мышей (BtCoV)). С целью проверки работоспособности теста в качестве модельных образцов использовали биологический материал от здоровых людей с добавлением синтезированных олигонуклеотидов, созданных на базе последовательности GenBank MN908947.3. Детекцию результатов амплификации RT-LAMP контролировали 3 методами: наблюдением за изменением цвета реакционной смеси, определением уровня флуоресценции и гель-электрофорезом. Показано, что данный тест имеет очень высокую специфичность в отношении SARS-CoV-2, поскольку во многих случаях с использованием других вирусов, таких как MERS (коронавирус Ближневосточного респираторного синдрома), BtCoV и MHV (вирус гепатита мышей), сигнал не наблюдался. Чувствительность также была исследована с пределом обнаружения до 1,02 фг на реакцию с применением смоделированных образцов. Наконец, подтверждена высокая клиническая ценность данного теста, поскольку он правильно определял молекулы нуклеиновых кислот SARSCoV-2 независимо от типа пробы (сыворотка, моча, слюна, мазки из рото- и носоглотки).

С целью создания быстрой и простой в применении тест-системы для диагностики COVID-19 Huang W.E. и соавт. разработали 4 набора праймеров для LAMP, нацеленные на различные области генома SARSCoV-2 [52]. Из них 2 относились к гену N вируса, а 2 других – к генам S и ORF1ab. Последний располагается близко к 5’-концу вирусной РНК, тогда как N находится у 3’-конца. Было высказано предположение, что эффективность детекции в разных регионах может быть неодинаковой, поскольку деградация РНК происходит от 5’- к 3’-концу в процессе её забора и экстракции. Праймеры FIP конъюгировали с FAM на 5’-конце, что оказалось эффективным и надёжным как для флуоресцентного, так и для колориметрического способа обнаружения продуктов амплификации. Подтверждена высокая специфичность всех праймеров для обнаружения SARS-CoV-2 и показано, что они не амплифицируют ДНК человека, благодаря чему могут использоваться при анализе клинических образцов. Точность тестов также оказалась приемлемой: показатели хорошо согласовывались с полученными при традиционной ОТ-ПЦР. В ходе обнаружения вирусной РНК наборы праймеров продемонстрировали результаты с чувствительностью от 2 до 20 копий РНК на реакцию (25 мкл) за 30 мин амплификации в зависимости от мишени. Выполнен дополнительный одноэтапный тест для оценки возможности исключения стадии выделения РНК в процессе RT-LAMP. Отмечено, что последняя на протяжении 40 мин привела к видимому невооружённым глазом изменению цвета, что указывает на осуществимость проведения RT-LAMP без этапа экстракции нуклеиновых кислот. Праймерные наборы правильно выявили все 8 положительных и 8 отрицательных клинических образцов, что служит доказательством возможности использования такого теста в качестве замены классическим методикам на основе ОТ-ПЦР для обнаружения SARS-CoV-2, особенно в условиях отсутствия специализированной лаборатории.

С начала 2020 г. создано значительное количество тест-систем для экспресс-диагностики SARS-CoV-2 на основе LAMP и опубликованы соответствующие статьи. Только поиск по базе PubMed даёт свыше 80 работ (начиная с марта 2020 г.), имеющих отношение к тестированию новой коронавирусной инфекции с помощью петлевой изотермической амплификации. При этом сюда не входят статьи в статусе препринта, а также не публикуемые в открытой печати коммерческие решения. В частности, разработано несколько сетов праймеров, специфичных к различным генам нового коронавируса [53], и продемонстрированы их весьма высокие показатели чувствительности и специфичности. В другом случае в целях определения результатов амплификации использован портативный прибор на базе смартфона для выполнения конечной флуоресцентной детекции LAMP-образцов на микрофлюидном чипе [54]. Показано, что значения специфичности при диагностике посредством LAMP могут приближаться к 100% [55], а чувствительности – превышать 90%. В работе Dao Thi V.L. и соавт. [56] описана процедура RT-LAMP, которая надёжно обнаруживала РНК SARS-CoV-2 с пороговым значением цикла в ОТ-ПЦР до 30 при чувствительности 97,5% и специфичности 99,7%. Опубликован также протокол без предварительного выделения нуклеиновой кислоты, который сохранил отличную специфичность (99,5%), хотя и показал снижение чувствительности (86% для количества циклов ПЦР с превышением порогового значения флюоресценции (Ct) 3 копий на 1 мл. В тестах от «Эвотэк-Мирай Геномикс» (Россия – Япония) реализован модифицированный метод петлевой изотермической амплификации (SmartAmp), который по точности не уступает технологии ПЦР, но сокращает время тестирования более чем в 4 раза. Значение чувствительности заявлено производителем как 10 2 копий на 1 мл. В наборе реагентов для выявления РНК нового коронавируса методом RT-LAMP от НПФ «Литех» (Россия) аналитических характеристик не заявлено. Был также разработан комплекс («Синтол», Россия) [64] для проведения реакции RT-LAMP с целью обнаружения специфических фрагментов РНК нового коронавируса посредством флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Его применение позволяет выявить 2 мишени в одной пробирке: фрагмент вирусной РНК и фрагмент ДНК внутреннего положительного контроля, исключающий ложноотрицательный результат; время анализа – не более 40 мин. Экспресс-тест от ООО «Система-БиоТех» (Россия) позволяет определять наличие SARS-CoV-2 за 20 мин. Система предназначена для диагностики на всех стадиях заболевания, может использоваться для скрининга в любых медицинских организациях; детекция вируса происходит по изменению цвета реакционной смеси в пробирке. Кроме того, различными организациями в РФ ведутся работы по локализации производства реагентов для создания тестов на базе LAMP, что, безусловно, приведёт к снижению их стоимости и более быстрому внедрению в широкую клиническую практику. Анонсированный в начале 2021 г. экспресс-тест для выявления РНК SARS-CoV-2 от ФБУН ЦНИИ эпидемиологии (Россия), основанный на реакции LAMP и разработанный полностью на базе ферментов отечественного производства, является одним из важных этапов в будущем переходе от традиционных диагностических систем на основе ПЦР на технологии нового поколения.

6. Заключение

Быстрые, недорогие и удобные для пользователя методы молекулярной диагностики – важное подспорье в борьбе со вспышками инфекционных заболеваний. Пандемия COVID-19 показала, что существует острая необходимость в наращивании объёмов тестирования, которые должны на порядки превышать уровень, достижимый с помощью существующих стандартных методик и подходов [65]. LAMP – инновационная технология амплификации генов, имеющая значительные перспективы в качестве инструмента обнаружения вирусных нуклеиновых кислот, особенно во время пандемии новой коронавирусной инфекции. В данном обзоре суммированы недавние достижения в тестировании с помощью LAMP для быстрой и точной детекции молекул РНК SARS-CoV-2. Несмотря на то что такие тесты до сих пор могут приводить к ошибочным результатам, особенно ложнонегативным, преимущества использования LAMP по-прежнему значительны. Одним из них является высокая скорость исследования – подтверждение результатов для типичной процедуры RT-LAMP происходит в несколько раз быстрее, чем при ОТ-ПЦР [23]. Отсутствие стадии денатурирования и возможное объединение процессов амплификации и детекции позволяют провести анализ с коротким временем получения результатов. Другим достоинством является простота применения, поскольку изотермический характер амплификации не требует использования дорогостоящего оборудования. Изотермические условия также помогают обеспечить высокую эффективность амплификации вследствие отсутствия потерь времени на термоциклирование (как у традиционной ОТ-ПЦР) [24]. Наконец, визуализация результатов относительно проста, поскольку в качестве индикатора можно использовать pH-зависимые красители либо степень помутнения раствора, что вполне можно увидеть невооружённым глазом. Поэтому, скорость, простота и экономическая эффективность процедуры делают LAMP хорошим кандидатом для мониторинга распространения вируса SARS-CoV-2.

Помимо улучшения чувствительности и специфичности за счёт тщательного дизайна праймеров для LAMP, в свете дальнейшей оптимизации крупномасштабного скрининга на COVID-19 одной из важных тенденций представляется разработка «истинного» одностадийного процесса LAMP в закрытой пробирке [17]. Такая процедура потребует только перенесения пользователем тампона для отбора проб в реакционную смесь с последующей амплификацией в закрытой пробирке при постоянной температуре. Таким образом, анализ может обнаруживать SARS-CoV-2 и другие патогены практически в домашних условиях с высоким уровнем детекции, подобно тому как это уже реализовано в тест-системе от компании Lucira™ (США). Вероятно, в ближайшем будущем молекулярная диагностика у постели больного станет действительно доступной, что не только повысит эффективность выявления инфекционных агентов, но и значительно снизит затраты системы здравоохранения. Сам подход может сыграть важную роль в борьбе с нынешними и будущими вспышками пандемий.

Список литературы

1. Woo P.C.Y., Huang Y., Lau S.K.P., Yuen K.Y. Coronavirus genomics and bioinformatics analysis. Viruses. 2010; 2(8): 1804-20. https://doi.org/10.3390/v2081803.

2. Wu A., Peng Y., Huang B., Ding X., Wang X., Niu P, et al. Genome composition and divergence of the novel coronavirus (2019-nCoV) originating in China. Cell Host Microbe. 2020; 27(3): 325-8. https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.02.001.

3. Udugama B., Kadhiresan P, Kozlowski H.N., Malekjahani A., Osborne M., Li V.Y.C., et al. Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection. ACS Nano. 2020; 14(4): 3822-35. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c02624.

4. Drosten C., Gottig S., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., et al. Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Rift Valley fever virus, Dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(7): 2323-30. https://doi.org/10.1128/jcm.40.7.2323-2330.2002.

5. Mackay I.M. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 2002; 30(6): 1292-305. https://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292.

6. Esbin M.N., Whitney O.N., Chong S., Maurer A., Darzacq X., Tjian R. Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection. RNA. 2020; 26(7): 771-83. https://doi.org/10.1261/rna.076232.120.

7. Shen M., Zhou Y., Ye J., Abdullah Al-Maskri A.A., Kang Y., Zeng S., et al. Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus. J. Pharm. Anal. 2020; 10(1): 97-101. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2020.02.010.

8. Broughton J.P., Deng X., Yu G., Fasching C.L., Servellita V, Singh J., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat. Biotechnol. 2020; 38(7): 870-4. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4.

9. Schmid-Burgk J.L., Schmithausen R.M., Li D., Hollstein R., Ben-Shmuel A., Israeli O., et al. LAMP-Seq: population-scale COVID-19 diagnostics using combinatorial barcoding. bioRxiv. 2020.04.06.025635. https://doi.org/10.1101/2020.04.06.025635.

10. Hueston L., Kok J., Guibone A., McDonald D., Hone G., Goodwin J., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infect. Dis. 2020; 7(9): ofaa387. https://doi.org/10.1093/ofid/ofaa387.

11. Kiselev D., Matsvay A., Abramov I., Dedkov V., Shipulin G., Khafizov K. Current trends in diagnostics of viral infections of unknown etiology. Viruses. 2020; 12(2): 211. https://doi.org/10.3390/v12020211.

12. Blanco L., Bemad A., Lazaro J.M., Martin G., Garmendia C., Salas M. Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication. J. Biol. Chem. 1989; 264(15): 8935-40.

13. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991; 350(6313): 91-2. https://doi.org/10.1038/350091a0.

14. Piepenburg O., Williams C.H., Stemple D.L., Armes N.A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006; 4(7): e204. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040204.

15. Vincent M., Xu Y., Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004; 5(8): 795-800. https://doi. org/10.1038/sj.embor.7400200.

16. Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000; 28(12): E63. https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63.

17. Thompson D., Lei Y. Mini review: Recent progress in RT-LAMP enabled COVID-19 detection. Sens. Actuators Rep. 2020; 2(1): 100017. https://doi.org/10.1016/j.snr.2020.100017.

18. Francois P., Tangomo M., Hibbs J., Bonetti E.J., Boehme C.C., Notomi T., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunol. Med Microbiol. 2011; 62(1): 41-8. https://doi.org/10.1111j.1574-695X.2011.00785.x.

19. Rodel J., Egerer R., Suleyman A., Sommer-Schmid B., Baier M., Henke A., et al. Use of the variplex™ SARS-CoV-2 rT-LAMP as a rapid molecular assay to complement RT-PCR for COVID-19 diagnosis. J. Clin. Virol. 2020; 132: 104616. https://doi.org/10.1016/).jcv.2020.104616.

20. El-Tholoth M., Branavan M., Naveenathayalan A., Balachandran W. Recombinase polymerase amplification-nucleic acid lateral flow immunoassays for Newcastle disease virus and infectious bronchitis virus detection. Mol. Biol. Rep. 2019; 46: 6391-7. https://doi.org/10.1007/s11033-019-05085-y.

21. Lamb L.E., Bartolone S.N., Ward E., Chancellor M.B. Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. PLoS One. 2020; 15(6): e0234682. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0234682.

22. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell Probes. 2002; 16(3): 223-9. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415.

23. Parida M., Sannarangaiah S., Dash P.K., Rao P.V.L., Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med. Virol. 2008; 18(6): 407-21. https://doi.org/10.1002/rmv.593.

24. Sahoo P.R., Sethy K., Mohapatra S., Panda D. Loop mediated isothermal amplification: An innovative gene amplification technique for animal diseases. Vet. World. 2016; 9(5): 465-9. https://doi.org/10.14202/vetworld.2016.465-469.

25. Mahony J., Chong S., Bulir D., Ruyter A., Mwawasi K., Waltho D. Multiplex loop-mediated isothermal amplification (M-LAMP) assay for the detection of influenza A/H1, A/H3 and influenza B can provide a specimen-to-result diagnosis in 40 min with single genome copy sensitivity. J. Clin. Virol. 2013; 58(1): 127-31. https://doi.org/10.1016/jjcv.2013.06.006.

26. Foo P.C., Chan Y.Y., Mohamed M., Wong W.K., Nurul Najian A.B., Lim B.H. Development of a thermostabilised triplex LAMP assay with dry-reagent four target lateral flow dipstick for detection of Entamoeba histolytica and non-pathogenic Entamoeba spp. Anal. Chim. Acta. 2017; 966: 71-80. https://doi.org/10.1016j.aca.2017.02.019.

27. Mori Y., Nagamine K., Tomita N., Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 2001; 289(1): 150-4. https://doi.org/10.1006/bbrc.2001.5921.

28. Yu L., Wu S., Hao X., Dong X., Mao L., Pelechano V., et al. Rapid detection of COVID-19 coronavirus using a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic platform. Clin. Chem. 2020; 66(7): 975-7. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa102.

29. Karthik K., Rathore R., Thomas P., Arun T.R., Viswas K.N., Dhama K., et al. New closed tube loop mediated isothermal amplification assay for prevention of product cross-contamination. MethodsX. 2014; 1: 137-43. https://doi.org/10.1016/j.mex.2014.08.009.

30. Tanner N.A., Zhang Y., Evans T.C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. Biotechniques. 2015; 58(2): 59-68. https://doi.org/10.2144/000114253.

31. Wastling S.L., Picozzi K., Kakembo A.S.L., Welburn S.C. LAMP for human African trypanosomiasis: a comparative study of detection formats. PLoS Negl. Trop. Dis. 2010; 4(11): e865. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000865.

32. Iwamoto T., Sonobe T., Hayashi K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum samples. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(6): 2616-22. https://doi.org/10.1128/jcm.41.6.2616-2622.2003.

33. Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 2008; 3(5): 877-82. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.57.

34. Gandelman O.A., Church V.L., Moore C.A., Kiddle G., Carne C.A., Parmar S., et al. Novel bioluminescent quantitative detection of nucleic acid amplification in real-time. PLoS One. 2010; 5(11): e14155. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014155.

35. Roy S., Wei S.X., Ying J.L.Z., Safavieh M., Ahmed M.U. A novel, sensitive and label-free loop-mediated isothermal amplification detection method for nucleic acids using luminophore dyes. Biosens. Bioelectron. 2016; 86: 346-52. https://doi.org/10.1016j.bi-os.2016.06.065.

36. Chou P.H., Lin Y.C., Teng P.H., Chen C.L., Lee P.Y. Real-time target-specific detection of loop-mediated isothermal amplification for white spot syndrome virus using fluorescence energy transfer-based probes. J. Virol. Methods. 2011; 173(1): 67-74. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2011.01.009.

38. Nyan D.C., Swinson K.L. A novel multiplex isothermal amplification method for rapid detection and identification of viruses. Sci. Rep. 2015; 5: 17925. https://doi.org/10.1038/srep17925.

39. Liu W., Huang S., Liu N., Dong D., Yang Z., Tang Y., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci. Rep. 2017; 7: 40125. https://doi.org/10.1038/srep40125.

40. Wang L., Yang C.J., Medley C.D., Benner S.A., Tan W. Locked nucleic acid molecular beacons. J. Am. Chem. Soc. 2005; 127(45): 15664-5. https://doi.org/10.1021/ja052498g.

41. Tani H., Teramura T., Adachi K., Tsuneda S., Kurata S., Nakamura K., et al. Technique for quantitative detection of specific DNA sequences using alternately binding quenching probe competitive assay combined with loop-mediated isothermal amplification. Anal. Chem. 2007; 79(15): 5608-13. https://doi.org/10.1021/ac070041e.

42. Nazarenko I., Pires R., Lowe B., Obaidy M., Rashtchian A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 2002; 30(9): 2089-195. https://doi.org/10.1093/nar/30.9.2089.

43. Gadkar V.J., Goldfarb D.M., Gantt S., Tilley P.A.G. Real-time detection and monitoring of loop mediated amplification (LAMP) reaction using self-quenching and de-quenching fluorogenic probes. Sci. Rep. 2018; 8(1): 5548. https://doi.org/10.1038/s41598-018-23930-1.

44. Ayukawa Y., Hanyuda S., Fujita N., Komatsu K., Arie T. Novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay with a universal QProbe can detect SNPs determining races in plant pathogenic fungi. Sci. Rep. 2017; 7(1): 4253. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04084-y.

45. Zerilli F., Bonanno C., Shehi E., Amicarelli G., Adlerstein D., Makrigiorgos G.M. Methylation-specific loop-mediated isothermal amplification for detecting hypermethylated DNA in simplex and multiplex formats. Clin. Chem. 2010; 56(8): 1287-96. https://doi.org/10.1373/clinchem.2010.143545.

46. Kouguchi Y., Fujiwara T., Teramoto M., Kuramoto M. Homogenous, real-time duplex loop-mediated isothermal amplification using a single fluorophore-labeled primer and an intercalator dye: Its application to the simultaneous detection of Shiga toxin genes 1 and 2 in Shiga toxigenic Escherichia coli isolates. Mol. Cell Probes. 2010; 24(4): 190-5. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2010.03.001.

47. Tanner N.A., Zhang Y., Evans T.C. Jr. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 2012; 53(2): 81-9. https://doi.org/10.2144/0000113902.

48. Kubota R., Jenkins D.M. Real-time duplex applications of Loop-mediated AMPlification (LAMP) by assimilating probes. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16(3): 4786-99. https://doi.org/10.3390/ijms16034786.

49. Jiang Y.S., Bhadra S., Li B., Wu Y.R., Milligan J.N., Ellington A.D. Robust strand exchange reactions for the sequence-specific, real-time detection of nucleic acid amplicons. Anal. Chem. 2015; 87: 3314-20. https://doi.org/10.1021/ac504387c.

50. Kumar Y., Bansal S., Jaiswal P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf 2017; 16(6): 1359-78. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12309.

51. Kidd M., Richter A., Best A., Mirza J., Percival B., Mayhew M., et al. S-variant SARS-CoV-2 is associated with significantly higher viral loads in samples tested by ThermoFisher TaqPath RT-QPCR. medRxiv. 2020; 2020.12.24.20248834. https://doi.org/10.1101/202 0.12.24.20248834.

52. Huang W.E., Lim B., Hsu C.C., Xiong D., Wu W., Yu Y, et al. RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Microb. Biotechnol. 2020; 13(4): 950-61. https://doi.org/10.1111/1751-7915.13586.

53. Park G.S., Ku K., Baek S.H., Kim S.J., Kim S.I., Kim B.T., et al. Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J. Mol. Diagn. 2020; 22(6): 729-35. https://doi.org/10.1016/jjmoldx.2020.03.006.

54. Sun F., Ganguli A., Nguyen J., Brisbin R., Shanmugam K., Hirsch-berg D.L., et al. Smartphone-based multiplex 30-minute nucleic acid test of live virus from nasal swab extract. Lab. Chip. 2020; 20(9): 1621-7. https://doi.org/10.1039/d0lc00304b.

55. Jiang M., Pan W., Arasthfer A., Fang W., Ling L., Fang H., et al. Development and validation of a rapid, single-step reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system potentially to be used for reliable and high-throughput screening of COVID-19. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020; 10: 331. https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.00331.

56. Dao Thi V.L., Herbst K., Boerner K., Meurer M., Kremer L.P., Kirrmaier D., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Sci. Transl. Med. 2020; 12(556): eabc7075. https://doi.org/10.1126/sci-translmed.abc7075.

57. Tian F., Liu C., Deng J., Han Z., Zhang L., Chen Q., et al. A fully automated centrifugal microfluidic system for sample-to-answer viral nucleic acid testing. Sci. China Chem. 2020; 1-9. https://doi.org/10.1007/s11426-020-9800-6.

58. Ganguli A., Mostafa A., Berger J., Aydin M.Y., Sun F., de Ramirez S.A.S., et al. Rapid isothermal amplification and portable detection system for SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2020; 117(37): 22727-35. https://doi.org/10.1073/pnas.2014739117.

59. Rohaim M.A., Clayton E., Sahin I., Vilela J., Khalifa M.E., Al-Natour M.Q., et al. Artificial intelligence-assisted loop mediated isothermal amplification (AI-LAMP) for rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 2020; 12(9): 972. https://doi.org/10.3390/v12090972.

60. Xiong H., Ye X., Li Y., Wang L., Zhang J., Fang X., et al. Rapid differential diagnosis of seven human respiratory coronaviruses based on centrifugal microfluidic nucleic acid assay. Anal. Chem. 2020; 92(21): 14297-302. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c03364.

61. Mautner L., Baillie C.K., Herold H.M., Volkwein W., Guertler P., Eberle U., et al. Rapid point-of-care detection of SARS-CoV-2 using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Virol. J. 2020; 17(1): 160. https://doi.org/10.1186/s12985-020-01435-6.

62. Mohon A.N., Oberding L., Hundt J., van Marle G., Pabbaraju K., Berenger B.M., et al. Optimization and clinical validation of dual-target RT-LAMP for SARS-CoV-2. J. Virol. Methods. 2020; 286: 113972. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2020.113972.

63. Schermer B., Fabretti F., Damagnez M., Di Cristanziano V, Heger E., Arjune S., et al. Rapid SARS-CoV-2 testing in primary material based on a novel multiplex RT-LAMP assay. PLoS One. 2020; 15(11): e0238612. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238612.

64. Varlamov D.A., Blagodatskikh K.A., Smirnova E.V., Kramarov V.M., Ignatov K.B. Combinations of PCR and isothermal amplification techniques are suitable for fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 viral RNA. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020; 8: 604793. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.604793.

Об авторах

111123, Москва, Новогиреевская 3а

111123, Москва, Новогиреевская 3а

111123 Москва, Новогиреевская 3а

111123, Москва, Новогиреевская 3а

111123, Москва, Новогиреевская 3а

Для цитирования:

Хафизов К.Ф., Петров В.В., Красовитов К.В., Золкина М.В., Акимкин В.Г. Экспресс-диагностика новой коронавирусной инфекции с помощью реакции петлевой изотермической амплификации. Вопросы вирусологии. 2021;66(1):17-28. https://doi.org/10.36233/0507-4088-42

For citation:

Khafizov K.F., Petrov V.V., Krasovitov K.V., Zolkina M.V., Akimkin V.G. Rapid diagnostics of novel coronavirus infection by loop-mediated isothermal amplification. Problems of Virology. 2021;66(1):17-28. https://doi.org/10.36233/0507-4088-42

Источник