Что показывает оптическая плотность раствора

Оптическая плотность растворов при прочих равных условиях прямо пропорциональна концентрации вещества и толщине поглощаемого слоя

Такая формулировка известна как закон Бугера-Ламберта-Бера, или основного закона фотометрии. Графическое выражение закона Бугера-Ламберта-Бера:

А

Рис. 1.1.6. С

Из основного закона колориметрии вытекает важное в практическом смысле следствие.

Нальем в узкий стеклянный цилиндр с плоским дном раствор, какого- либо окрашенного вещества и будем наблюдать интенсивность окраски сверху при условии, что пучок света падает на раствор снизу, через дно цилиндра.

При толщине поглощающего слоя l₁, концентрация вещества будет C₁ и мощность выходящего потока света W₁. Тогда, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера

Затем с помощью растворителя увеличим объем раствора в два раза, до толщины слоя l₂.

При разбавлении концентрация вещества уменьшилась в два раза, т.е. C₂=C₁/C₂, но число частиц во всем объеме раствора по пути проходящего света осталось тем же, поэтому доля во втором случае равна доле поглощенного света в первом случае, а тогда и оптические свойства будут равны:

Из уравнения (7) следует:

при одинаковой интенсивности окраски двух растворов данного вещества их концентрации обратно пропорциональные толщинам поглощающих свет слоев.

Если в уравнении А=ECL, С имеет размерность моль/л, L выражается в см, величина E является молярным коэффициентом погашения или молярным коэффициентом абсорбции и обозначается символом E_µ

Молярный коэффициент поглощения не зависит от концентрации раствора и является мерой чувствительности определений.

Разберем, что это значит на примере. Пусть мы имеем два раствора (окрашенные) меди: гексааммиакат меди с E_µ = 500, дитизонат меди E_µ=50000.При каких концентрациях меди реакциями с аммиаком и дитизоном можно получить одинаковые оптические плотности при одинаковой толщине слоя?

Согласно основному закону фотометрии для гексааммиакат меди:

Для дитизоната меди:

ВЫВОД: чем больше молярный коэффициент поглощения, тем чувствительней определение.

Молярный коэффициент поглощения можно рассчитать из уравнения:

Для характеристики цветовых растворов веществ строятся кривые светопоглощения. Кривая спектра поглощения:

A= f(λ)

Рис. 1.1.7.

Пользуясь кривыми светопоглощения, выбирают длину волны для измерения оптической плотности. Наибольшая величина молярного коэффициента поглощения, а, следовательно, и наибольшая чувствительность достигается при максимуме светопоглощения.

1. Для того чтобы правильно подобрать окрашенное соединение, необходимо по справочнику выбрать такое соединение данного иона, при котором молярный коэффициент поглощения будет наибольшим.

2. Для правильного выбора светофильтра (λ) необходимо построить кривую светопоглощения (кривая абсорбции). По максимуму определить необходимую длину волны.

3. Выбираем толщину кювет такой, чтобы оптическая плотность уложилась в интервал 0,2-0,8.

ис.1.8.

РрррРис. 1.1.8.

Максимум светопоглощения для меди наблюдается при светофильтре №2, при этом для соли Ni 2+ наблюдается минимум светопоглощения, следовательно, соль Ni 2+ не мешает определению меди.

2. Измерения ведут при той длине волны, где наблюдается максимум светополощения на кривой светопоглощения для данного иона и минимума для мешающих ионов.

Лекция №3 Фотометрический метод анализа.

1. Условия образования окрашенных соединений.

Качественное обнаружение отклонения от закона Б-Л-Б.

Количественное определение отклонений от закона Б-Л-Б.

Влияние прочности комплексных соединений на отклонения.

Влияние посторонних комплексообразующих ионов.

Влияние концентрации водородных ионов.

Влияние температуры и времени.

2. Экстракция в фотометрическом методе анализа.

3. Фотометрический анализ многокомпонентных растворов.

4. Определение высоких концентраций веществ методом дифференциальной фотометрии.

При выводе закона Б-Л-Б предполагается, что частицы при разбавлении раствора остаются неизмененными, т.е. не взаимодействуют с молекулами растворителя и ионами других веществ, присутствующих в растворе.

В реальных условиях окрашенные вещества при разбавлении или при действии посторонних веществ, часто разрушаются. Вследствие этого нарушается прямо пропорциональная зависимость между концентрацией и оптической плотностью раствора – наблюдаются отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера.

1.1 Качественно эти отклонения можно обнаружить при построении графиков A=f(c) и A=f (ℓ).

Рис. 1.1.9. С

Отклонение от основного закона поглощения называется положительными или отрицательными в зависимости от расположения экспериментальной линии на графике выше или ниже теоретической прямой.

1.2. Для количественного определения отклонения от закона Б-Л-Б измеряют оптическую плотность исходного раствора A₀ с концентрацией вещества C₁ при толщине слоя ℓ₁. Затем разбавляют исходный раствор в n раз и снова измеряют оптическую плотность A_n, раствора с концентрацией C₂=C₁/n при

толщине слоя nℓ₁, если при разбавлении не увеличивается диссоциация

комплексного соединения, то A₀=A_n, а дельта =0, т.е. закон Б-Л-Б выполняется, если A₀ не равна A_n, то дельта =A₀-A_n/A₀, закон Б-Л-Б не выполняется, т.е. наблюдаются отклонения.

1.3. В первую очередь отклонения могут наблюдаться из-за непрочности комплексных соединений, т.к. практическое большинство окрашенных веществ – комплексные. Чем больше прочен комплекс, тем больше образуется окрашенных частиц и тем больше устойчивость. Если при разбавлении интенсивность окраски раствора уменьшается сильнее, чем следует ожидать, это свидетельствует о малой прочности окрашенного комплекса.

1.5 Кислотность раствора, при которой осуществляется реакция, в фотометрическом анализе имеет большое значение.

а) рассмотрим окрашенные комплексы с анионами сильных кислот:

Образование окрашенного комплекса идет по уравнению:

При этом происходит разрушение окрашенного комплекса.

ВЫВОД (1): Если комплексное соединение образовано анионами сильных кислот – работать необходимо в кислых средах.

б) Комплексы с анионами слабых кислот. К этой группе относятся большинство органических реагентов. В общем, виде такие кислоты можно изобразить следующим образом:

Увеличение концентрации R можно добиться повышения pH раствора, при этом:

и равновесие реакции:

Увеличение концентрации ионов H + приведет к сдвигу равновесия вправо, что будет способствовать разрушению комплексного соединения.

ВЫВОД(2):Если комплексное соединение образовано анионами слабых кислот – работать необходимо в щелочных средах.

в) При использовании комплексов следует предусматривать возможность образования поочередно комплексов с различным числом координированных частиц реагента

Реактив обладает индикаторными свойствами.

Среди реактивов, являющихся слабыми органическими кислотами, много соединений обладающих индикаторными свойствами. Такие реактивы способны изменять свою окраску с изменением концентрации ионов водорода.

Например: при pH >4,5 образует с ализарином соединения, растворы которых окрашены в красный цвет. Растворы ализарина при этом значении pH желтого цвета, но при pH >5,5 ализарин изменяет окраску на красно-фиолетовую, т.е. даже в отсутствии алюминия получается красная окраска раствора. Поэтому определение алюминия с ализарином рекомендуется проводить в интервале значений pH 4,5-5,0.

д) Температура и время

При стоянии растворы выцветают. Температура влияет по–разному, в зависимости от природы раствора.

Источник

Плотность

Плотность — это интенсивность распределения одной величины по другой.

Термин объединяет несколько различных понятий, таких как: плотность вещества; оптическая плотность; плотность населения; плотность застройки; плотность огня и многие другие. Рассмотрим два понятия, касающихся неразрушающего контроля.

1. Плотность вещества.

В физике плотностью вещества называют массу этого вещества, содержащуюся в единице объёма при нормальных условиях. Тела одинакового объёма, изготовленные из различных веществ, обладают различной массой, что и характеризует их плотность. К примеру, два куба одинаковых размеров, изготовленные из чугуна и алюминия, будут отличаться весом и плотностью.

Чтобы вычислить плотность какого-либо тела, нужно точно определить его массу и разделить её на точный объём этого тела.

кг/м 3
— Единицы измерения
плотности в международной
системе единиц (СИ)

г/см 3
— Единицы измерения
плотности в системе СГС

Выведем формулу вычисления плотности.

Для примера определим плотность бетона. Возьмём бетонный кубик весом 2,3 кг со стороной 10 см. Подсчитаем объём кубика.

Подставляем данные в формулу.

Бетонный куб со стороной 10 см

График зависимости плотности воды от температуры

От чего зависит плотность вещества

Плотность вещества меняется и при изменении его агрегатного состояния. Она скачкообразно растёт при переходе вещества из газообразного в жидкое состояние, и далее — в твёрдое. Здесь также есть исключения: плотность воды, висмута, кремния и некоторых других веществ снижается при затвердевании.

Чем измеряется плотность вещества

Для измерения плотности различных веществ применяются специальные приборы и приспособления. Так, плотность жидкостей и концентрация растворов измеряется различными ареометрами. Несколько разновидностей пикнометров предназначены для измерения плотности твёрдых тел, жидкостей и газов.

Металлический пикнометр

2. Оптическая плотность.

В физике оптической плотностью называют способность прозрачных материалов поглощать свет, а непрозрачных — отражать его. Это понятие в большинстве случаев характеризует степень ослабления светового излучения при прохождении его через слои и плёнки различных веществ.

Оптическую плотность принято выражать десятичным логарифмом отношения падающего на объект потока излучения к потоку, прошедшему через объект или отражённому от него:

Оптическая плотность=логарифм (поток излучения, падающий на объект где D – оптическая плотность; F₀ – поток излучения, падающий на объект; F – поток излучения, прошедший через объект или отражённый от него).

В радиографическом методе контроля оптическая плотность является одним из основных параметров, определяющих пригодность снимков для их расшифровки. Допустимые значения этого параметра обусловлены требованиями ГОСТ 7512-82 (раздел 6 – расшифровка снимков).

Оптическая плотность измеряется в Беллах, сокращённое обозначение — «Б». Для измерения оптической плотности используется денситометр. Прибор сравнивает яркость негатоскопа и яркость точки на плёнке. По этим двум значениям прибор определяет оптическую плотность. Чем выше плотность, тем темнее изображение.

Денситометр ДП 5004

Источник

Фотометрия в лабораторной диагностике

В дальнейшем, для простоты в статье будет рассматриваться только горизонтальная фотометрия в проходящем свете (то есть измерение оптической плотности растворов).

Итак, все начинается с простейшей схемы прибора, который используется для фотометрической детекции.

Схема простейшего фотометра

В простейшем случае световой поток от источника света налетает на исследуемый раствор. После прохождения через раствор ослабленный световой поток попадает на фотодетектор. Поскольку условия, при которых проводится измерение подбираются так, что вся оптическая плотность раствора обусловлена присутствием одного вещества, то измеряя оптическую плотность мы можем, в конечном итоге, определять концентрацию этого вещества.

Физические основы фотометрии

Физический принцип, лежащий в основе данного процесса, называется законом Бугера-Ламберта-Берра.

Таким образом, если принять, что в условиях измерения которые мы можем стандартизировать величина e_λ известна, толщина поглощающего слоя известна и вообще то определяется нами, величины I и I₀ выясняются в процессе измерения, следовательно зная все эти показатели в конечном счете можно вычислить концентрацию исследуемого вещества.

Прологарифмировав нашу исходную формулу по основанию 10, получим:

Далее путем нехитрых преобразований получаем:

Величина lg I₀/I называется оптической плотностью и как правило обозначается буквами A или D или OD. Поскольку величины e_λ и l являются постоянными при каждом измерении, то оптическая плотность линейно зависит только от концентрации измеряемого вещества в растворе, следовательно измеряя оптическую плотность мы можем определить концентрацию.

Проведение калибровки

Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.

Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.

Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.

На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).

Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.

Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.

Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.

Калибровочный график

В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.

Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.

В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:

Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.

Выбор длинны волны

При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.

Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.

Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.

Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.

Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.

Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.

Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:

После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.

Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.

Данная реакция широко используется как индикаторная многими производителями для определения ЛДГ, АЛТ, АСТ, КФК, КФК-МБ, мочевины и глюкозы (гексокиназным методом).

Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.

В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.

Оптический тест Варбурга

В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.

Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.

Основные типы монохроматоров:

Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.

Фотометрия на определенной длинне волны

Бихроматическое измерение

В лабораторной диагностике зачастую возникают ситуации, когда нужно провести измерение оптической плотности на двух длинах волн. Такие измерения называются бихроматическими.

Теоретическое обоснование проведения такого измерения следующее: в биологических жидкостях присутствует огромное количество различных веществ, некоторые из которых могут обладать собственной оптической плотностью или вступать в неспецифические реакции с компонентами диагностический наборов, при этом зачастую биологические жидкости могут проявлять свойства коллоидных растворов и не только поглощать, но и рассеивать свет. Поэтому для того, чтобы учесть влияние этих интерферирующих факторов оптическая плотность рассчитывается как разность между оптической плотностью на основной длине волны (о ней уже шла речь выше) и другой длине волны, которая обычно называется опорной или отсекающей, оптическая плотность на которой, как считается, обусловлена неспецифическими факторами.

Приведенная в предыдущем разделе конструктивная схема фотометра называется монохроматической. Исторически она возникла первой, но в современных машинах практически не используется.

Монохроматической она называется потому, что в каждый конкретный момент времени считывание оптической плотности проводится только на одной длине волны и для того, чтобы провести бихроматическое измерение нужно, например, физически поменять светофильтр или изменить угол поворота призмы или дифракционной решетки. В некоторых вариантах проведения фотометрии это неприемлемо (например, кинетические измерения). Поэтому в дальнейшем была разработана полихроматическая схема детекции, которая позволяет считывать оптическую плотность раствора на нескольких длинах волн. Этого было достигнуто разложением полихроматического света в спектр уже после прохождения через поглощающий раствор (то есть перенесением монохроматора за кювету с образцом) и установкой сразу нескольких фотодетекторов для разных длин волн.

Полихроматическая схема детекции

Такая схема позволяет проводить измерение на нескольких длинах волн одновременно.

Методы расчета концентрации

Существует несколько способов расчета концентрации раствора по полученной оптической плотности.

Наиболее простым является метод расчета по конечной точке.

При таком методе график зависимости оптической плотности от концентрации измеряемого вещества выглядит следующим образом:

Конечная точка

При этом после небольшого времени задержки (lag-time), связанного с перемешиванием биоматериала с компонентами диагностического набора и их термостатированием происходит резкое возрастание оптической плотности до определенного уровня, пропорционального концентрации определяемого вещества, после выхода оптической плотности на «плато» дальше она уже практически не изменяется (достигает конечной точки).

Данный метод не пригоден для измерения активности ферментов, а биохимическими методами измеряется именно активность ферментов, а не их концентрация.

Для измерения активности ферментов используется кинетический метод расчета концентрации график которого выглядит примерно так:

Кинетика

После некоторого времени задержки, обусловленного теми же факторами, происходит непрерывное изменение оптической плотности (на графике нарастание) с постоянной скоростью, которая и определяет активность фермента. При этом скорость реакции определяется как тангенс угла наклона графика изменения оптической плотности. Чем круче изменяется оптическая плотность, тем больше активность фермента.

Данные два метода являются основными.

Помимо них так же еще существует турбидиметрический метод измерения, при помощи которого измеряются высокомолекулярные вещества, обладающие антигенной природой, но данный метод уже основан на других физических принципах и к фотометрии не относится.

Источник