Что положено в основу люминесцентной микроскопии

Что положено в основу люминесцентной микроскопии

В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:

Люминесцентная микроскопия (лат. Lumen, luminis свет; греч. Micros малый + skopeo рассматривать, исследовать) – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.

Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биологическим микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов.

Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак – иллюминатор имеет ряд преимуществ:

Источниками освещения для люминесцентного микроскопа чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также лампы накаливания: ксеноновые и кварцево-галогенные.

Для возбуждения люминесценции при люминесцентной микроскопии обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зелёную область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычно стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям. В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт).

Люминесцентные микроскопы серии «Люмам»

Исследовательский люминесцентный микроскоп «Люмам И-3»

Рабочий люминесцентный микроскоп «Люмам Р-1»

Люминесцентная микроскопия органов и тканей.

Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патологической гистологии. Основными преимуществами Люминесцентной микроскопии являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим. методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию.

Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение. возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин В2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин В1 в щелочном растворе переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной кислоты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохимического количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.

Источник

Как работает люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — исследование, связанное со свечением объектов. Большинство из них не видны, т.к. используется ультрафиолетовое излучение. В некоторые образцы добавляют красители, взаимодействующие с соединениями.

Краткая историческая справка

Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.

Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.

Что такое люминесцентная микроскопия

При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.

Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.

Методы исследования

В люминесцентной микроскопии применяются различные методы исследований. Микробиологи используют флюорохромирование и реакцию иммунной флуоресценции. Вторую часто называют также методом флуоресцирующих тел.

Существует другой вид изучения молекул — конфокальная микроскопия. Она дает возможность исследовать частицы на той или иной глубине.

Флюорохромирование

Метод является распространенным в исследовании органов и тканей человека. Вторичную люминесценцию получают, обрабатывая образцы флюорохромами. Каждый предназначен для каких-либо целей.

Акридиновый оранжевый применяется для диагностики раковых заболеваний и инфаркта на ранних сроках. Ишемические участки имеют зелено-желтое свечение. Флюорохром применяют, чтобы выявлять кислые мукополисахариды. Если он взаимодействует с ДНК, появляется зеленая флуоресценция. Для реакции красителя на РНК характерна красная.

Кофеин 5 и родамин применяются для определения гликогена в печени. Фосфин 3Р — для выявления липидов. Аналогичными свойствами обладает смесь растворов бензпирена и кофеина. Второй должен быть насыщенным. При наличии липидов появляется бело-голубая люминесценция.

Тиофлавин окрашивает особые белковые соединения при амилоидозе. Для него характерно зеленое свечение. При такой болезни внутренних органов в них образуются амилоиды.

Морин используют для определения содержания кальция в тканях. После обработки спиртовым раствором образцы имеют зеленую люминесценцию.

Черный солохром применяют для выявления алюминия. Он сопровождается желто-оранжевым свечением.

Родамин 6Ж необходим для определения сурфактанта в тканях легких. На его наличие указывает оранжевая люминесценция.

Реакция иммунной флюоресценции

Благодаря методу флуоресцирующих тел выявляют антитела, гормоны, продукты метаболизма и др. Реакция иммунной флюоресценции определяет рак и инфекции на ранних стадиях. Возможности таких исследований расширило развитие иммунохимии. Сейчас небелковые соединения в тканях выявляют искусственными гаптенами.

Особенности исследования отдельных молекул и микроорганизмов

В теории можно сделать изображение какой-либо молекулы, используя оптические устройства, красящие вещества, ультрафиолет и светофильтр. Объект исследования должен флюоресцировать на темном фоне, а остальные частицы нет. Их цветовое значение близко к нулю.

Детектор микроскопа распознает не только излучение нужной молекулы, но и реагирует на иные фотоны. Они попадают на люминесцентное устройство от других источников света.

Сейчас для детального анализа образца применяют оптико-механические приборы и электронно-вычислительную технику. С помощью современного программного обеспечения ее подключают к монитору. На него выводится трехмерное изображение. После получения информации о координатах новых частиц компьютер микроскопа запоминает их расположение. Они исчезают с экрана.

Получить изображение объекта легко с помощью оптики, дополнительной техники и ПО. Качество снимка будет ниже, чем при применении люминесцентного устройства. Иногда для наблюдений такой способ допускается, т.к. не всегда требуется сверхвысокое разрешение.

Для осуществления наблюдения понадобятся:

Сфера применения люминесцентной микроскопии

Флюоресцентный микроскоп незаменим в биологии, медицине, а также смежных областях. Он позволяет проводить точные исследования клеток и тканей организмов. Главным преимуществом люминесцентной микроскопии считается возможность увидеть образец изнутри. Остальные приборы изучают лишь поверхность объекта.

Флюоресцентные устройства часто используют криминалисты. Они сравнивают образцы тканей и веществ для установления их принадлежности. Свечение применяется в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Оно помогает выделять бактерии и клеточные структуры из-за способности взаимодействовать лишь с нужными красителями.

Явление флуоресценции открыли в 1852 г., но громоздкие микроскопы имели плохое разрешение. Новейшие технологии позволяют использовать люминесцентные ферментные метки, делающие устройства компактными. Их разрешение обладает высоким качеством.

Метод люминесцентной микроскопии является незаменимым для:

Применение эффекта свечения нужной длины волны у молекул помогает распознать вирусы и бактерии с высочайшей точностью.

Другие микроскопы выявляют только наличие инфекции. Благодаря разрешению 1 нм получают четкие и яркие изображения.

Принцип работы люминесцентного микроскопа

Принцип работы устройства заключается в испускании излучения объектом исследования вслед за светом возбуждения — электромагнитной волной с ультрафиолетовым диапазоном. Иногда используются зеленые или синие лучи. Они являются видимыми.

В микроскоп устанавливают зеркало, направляющее на исследуемый образец поток света. Его источником является ксеноновая или ртутная лампа. Отдельные лучи поглощаются материалом, остальные отражаются и направляются в пространство. Под ним подразумевается и глаз человека. Отраженное свечение источника забирает слабое излучение — собственное свечение микрообъекта. Для его отделения от ультрафиолета перед линзами устройства размещают светофильтр. Он отсекает лучи с более короткой электромагнитной волной.

Люминесценция отличается двойственным происхождением.

Большинство веществ светятся самостоятельно из-за воздействия ультрафиолетовых лучей. В других случаях к образцам добавляют флюорохромы.

Преимущества люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия имеет множество достоинств. Основным является возможность изучения живых клеток и микроорганизмов. Исключается опасность их соединения или окрашивания, что провоцирует гибель. Поэтому ученые могут:

Пример наглядности результата

Ярким примером служит изучение глиальной ткани человеческого мозга с помощью оптического и фазово-контрастного устройства. При сравнивании изображения выводы может сделать любой человек, не имеющий специальных знаний.

При применении оптического микроскопа клетки мозга выглядят прозрачными. Можно увидеть только части, имеющие выраженное преломление, к примеру мембрану или ядро. Полученная картинка не подходит для подробного изучения образца.

При использовании метода фазового контраста детали хорошо различимы. На четком изображении видны мельчайшие клеточные структуры и места их соединения друг с другом.

Как интерпретировать

Образцы, окрашенные флюорохромами, рассматривают, увеличивая в 200-630 раз. Однако чаще используется значение 400. При изучении препаратов после обработки карболовым фуксином изображение увеличивают в 1000 раз. Поэтому поле зрения объектива на люминесцентном микроскопе намного больше, чем простом.

Например, при диагностике туберкулеза методом флуоресцентной микроскопии есть свои тонкости. Приводится рекомендуемое количество полей для просмотра. Мазок оценивают как отрицательный, применяя различную степень увеличения.

Источник

Микроскоп люминесцентный: цена высока, но оправданна

Люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы широко применяют в микробиологии, цитологических исследованиях и гистохимии. С их помощью удобно изучать живые клетки, диагностировать злокачественные образования, выявлять нуклеиновые кислоты, мукополисахариды и муцины. Это специализированные микроскопы, которые вряд ли пригодятся в домашних научных опытах или на уроке биологии в школе, но будут незаменимы в любой клинической лаборатории.

Люминесцентный микроскоп: принцип работы

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться или изменять свою окраску под воздействием лучей с определенной длины волны. Для наблюдения этих изменений используется специальный люминесцентный микроскоп, принцип работы которого состоит в том, чтобы намеренно вызывать свечение у наблюдаемого препарата. Для этого на микроскоп устанавливают особую систему освещения, способную запускать процесс люминесценции и передавать в окуляр картинку в видимом спектре. Давайте разберемся, из чего состоит эта система освещения.

Люминесцентный микроскоп: устройство

По своей сути флюоресцентный микроскоп – этот обычный световой микроскоп. Свои свойства он приобретает лишь благодаря нескольким особенностям. В качестве осветителей в нем используется ртутно-кварцевая или галогеновая кварцевая лампа. Она излучает ультрафиолетовый или синий свет, необходимый для возникновения люминесценции. На люминесцентный микроскоп всегда установлены светофильтры: пропускающий, теплозащитный и запирающий. Первый установлен перед источником света и необходим для пропуска возбуждающих люминесценцию ультрафиолетовых лучей и отсечения остального спектра. Второй служит для защиты оптики и препаратов от перегрева. Третий располагается на окуляре, поглощает ультрафиолетовое излучение и пропускает только свет люминесценции.

Специализированный микроскоп (люминесцентный) – это кусающаяся цена, ограниченная сфера применения, сложные настройка и использование. Однако это единственный тип микроскопа, который позволяет рассматривать прозрачные препараты, подсвеченные изнутри собственным светом. Эффект собственного свечения (люминесценции) используется в самых разных научных и прикладных исследованиях. Он помогает определять отдельные вирусы и бактерии, проводить сравнительный анализ органических тканей и клеток, экспериментировать с неорганическими веществами, окрашенными красителями.

4glaza.ru
Август 2017

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Источник

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — это фиксация при помощи микроскопа первичного либо вторичного люминесцентного свечения объектов.

Принцип люминесцентной микроскопии

Довольно большое количество веществ биологического происхождения имеют такую способность, как свечение, при воздействии на них света.

Такое свечение формируется по причине того, что объекты поглощают лучистую энергию, которая попадает на их поверхности. Длина волны при люминесценции больше, чем у поглощенного света.

Чем люминесцентный микроскоп отличается от обычного светового микроскопа?

Строение светового микроскопа отличается от люминесцентного. Дело в том, что люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов.

Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение.

Используются разновидности ламп, как, например, ртутно-кварцевая или галогенная кварцевая лампа. Ими оснащается все флуоресцентный микроскоп, они излучают свет в синем спектре.

Также используются специальные светофильтры, которые пропускают только ту часть света, которая способна возбудить люминесцентное свечение объекта. Также используются теплофильтры, которые противостоят перегреву остальных фильтров, оптической конструкции и самого исследуемого объекта.

Есть и объекты, которые не обладают люминесцентным свечением. Однако, это не проблема. Ведь есть возможность обработки их флюорохромами, специальными веществами, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными.

Именно по этому принципу люминесценцию разделяют на первичную и вторичную, соответственно, первичной называется та люминесценция, которой объекты обладают без какого-либо внедрения, а вторичной – при окрашивании их флюорохромами.

Применение люминесцентной микроскопии позволяет увеличить контрастность объекта, в микробиологии именно такая методика позволяет отчетливо рассмотреть органеллы и другие клеточные структуры.

Довольно большое значение имеет реакция иммунофлюоресценции в вирусологии, так как при помощи данной технологии меченные флюорохромом антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов. Такая технология может значительно помочь в экспресс- идентификации вирусных заболеваний.

Люминесцентная микроскопия имеет широкое распространения в современной науке и технике.

Источник

Световая, люминесцентная, электронная микроскопия – разные методы исследований

Изучение микромира – это одновременно и увлекательно, и сложно. Если в самом начале, сразу после зарождения микроскопии, ученым был доступен только один метод исследований, сейчас их насчитывается уже более десятка. Самые широко распространенные методы микроскопии – это люминесцентная, темнопольная, светлопольная, поляризационная, фазового контраста. Некоторые из них можно использовать и для любительских наблюдений. А вот, например, методы электронной микроскопии созданы для решения сугубо профессиональных задач.

Люминесцентная микроскопия

В люминесцентной микроскопии используется явление свечения веществ при облучении их ультрафиолетом. Разделяют понятия первичной и вторичной люминесценции. Первичную демонстрируют лишь редкие образцы, вторичная проявляется у всех веществ, окрашенных красителями (флюорохромами). При люминесцентном методе исследований образец поглощает короткие волны и излучает длинные, которые можно наблюдать в видимом диапазоне. Люминесцентная микроскопия в микробиологии используется для изучения нуклеиновых кислот в клетках, бактериоскопии возбудителей инфекций, цитохимических исследований живых микроорганизмов. Метод незаменим в диагностике заболеваний и широко применяется в медицине.

Методы люминесцентной микроскопии

В люминесцентной микроскопии применяются несколько методов исследований. В микробиологии обычно используют два из них: окрашивание флюорохромами (флюорохромирование) и метод флюоресцирующих антител. Последний еще называется реакцией иммунной флюоресценции (РИФ). Мы не будем углубляться в тщательное описание каждого метода, так как объема одной статьи для этого не хватит. Отметим, что существует еще конфокальная микроскопия – тоже метод люминесценции, который позволяет изучать образцы на некоторой глубине.

Поляризационная, конфокальная, электронная, люминесцентная микроскопия – это методы изучения микромира. Некоторые появились вместе с первыми микроскопами, другие же были придуманы в последние сто лет. Наука не стоит на месте, а способы наблюдений меняются, совершенствуются и становятся все более эффективными. Вы тоже можете совершенствовать свои умения, используя более современную и актуальную оптическую технику. В нашем интернет-магазине вы найдете микроскопы не только для любителей, но и для профессионалов. Наши консультанты готовы ответить на любые ваши вопросы, рассказать о выгодных предложениях и акциях. Звоните или пишите!

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Источник