Как выглядят бактериофаги под микроскопом
Что такое бактериофаги
Поделиться:
Инфекционные заболевания были бичом человечества до того момента, как начали появляться антибактериальные препараты. Обычно новую эру связывают с именем Флеминга и пенициллином. Однако на десять лет раньше было сделано открытие, которое, возможно, еще пригодится всем нам в будущем.
Убить убийцу
Говорят, война — это всегда огромный скачок в развитии хирургии. На самом деле не только: военные действия нередко способствовали продвижению онкотерапии и терапии инфекционных болезней.
Читайте также:
Медицина в годы ВОВ
Читайте также: Во время 1-й мировой войны канадский врач Феликс Д’Эррель изучал вспышку дизентерии среди солдат-французов. Это неприятное кишечное заболевание вызывается бактериями рода Shigellа, которых легко можно выделить из стула больных.
Врач заинтересовался случаем одного солдата, который полностью выздоровел, причем раньше, чем появилось улучшение у других, кого начали лечить одновременно с ним. Взяв у него пробы стула, Д’Эррель не обнаружил бактерий — что-то загадочное убило их.
Исследователь отфильтровал свой «материал», пропустив его через фильтр с настолько мелкими порами, что через них не могла бы пройти ни одна бактерия или какие-нибудь частицы испражнений. В полученный раствор врач добавил готовую культуру бактерий, взятых от другого больного, высадил все это в чашку Петри и стал ждать.
Профилактика и лечение острых кишечных инфекций
Через некоторое время начался рост бактериальной культуры, однако колонии были разорванными — словно что-то неведомое разъедало их изнутри. Взяв мазки из «пустых» областей, Д’Эррель добавил их в «хорошие», здоровые колонии шигелл — и в них тоже образовались пустоты.
Практика, обогнавшая теорию
Поскольку к этому моменту наш соотечественник Дмитрий Ивановский уже открыл вирусы, Д’Эррель предположил, что невидимый глазу убийца бактерий относится именно к ним. Понимая важность своего открытия, исследователь дал вирусам, поражающим бактерии, отдельное имя — бактериофаги.
Увидеть фагов удалось только после изобретения электронного микроскопа, а выяснить, чтó именно происходит при их контакте с бактериями, — и того позже. Поэтому в течение многих лет идея Д’Эрреля отвергалась значительной частью ученых, которым было трудно представить себе вирус, поражающий бактерию, но не причиняющий вреда человеку. К тому же опыты канадца удавалось повторить не всем и не всегда.
Однако врач, не дожидаясь никаких теоретических подтверждений своего открытия, перешел к практике. Он не мог, имея в руках лекарство, видеть умирающих людей — и принялся лечить солдат фаговым раствором. Правда, сперва Д’Эррель убедился в его безвредности традиционным для таких энтузиастов способом: сперва пил бактериофаг, затем впрыскивал себе под кожу.
Естественное против искусственного
Выяснив, что для человека бактериофаг совершенно не опасен, Д’Эррель вылечил многих пациентов, что принесло ему известность. Его исследования даже стали основой для художественного романа «Эрроусмит», позднее экранизированного Голливудом. Фаговые лекарства успешно производились и применялись — но уже в 40-х годах энтузиазм начал угасать.
Причиной этого стало открытие Флемингом пенициллина и появление большого числа антибиотиков. Врачи настороженно относились к идее лечения людей с помощью вирусов, а тут у них появилась альтернатива. Антибиотики — химические вещества, полученные искусственно, — не были живыми и казались медикам более надежными. Фармацевтические компании уловили настроения врачебного сообщества и, прекратив выпуск фагов, принялись множить антибиотики.
Бактериофаги сегодня
В наше время, когда антибиотикорезистентность является глобальной и очень опасной проблемой, бактериофаги снова заинтересовали ученых.
У них есть свои недостатки — например, не просто узкий, а суперузкий спектр действия: каждый фаг «умеет» убивать только один штамм бактерий — даже не вид, а штамм. Из-за этого, кстати, и проваливались регулярно попытки повторить эксперименты Д‘Эрреля: дизентерия в двух разных частях армии, идентичная по симптомам и течению, могла быть вызвана разными «вариантами» шигелл.
Однако эту проблему сегодня может решить постепенное распространение такого диагностического метода, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая точно определит штамм бактерии.
Бактериофаги не могут проникать через стенку клетки, поэтому они пока бессильны против тех возбудителей, которые паразитируют внутриклеточно. «Пока» — потому что активные исследования в этом направлении, возможно, помогут фагам пробираться в самые потаенные места.
А вот среди плюсов бактериофагов с ходу можно выделить два: во-первых, они совершенно безвредны для человека, поскольку вообще никак не взаимодействуют с его организмом — только с бактериями.
И, во-вторых, бактерий они убивают не всех, а значит, не имеют традиционного недостатка применения антибиотиков — возникновения дисбиоза. Так что сегодня бактериофаги стали перспективной областью — и в каком-то смысле новой надеждой человечества.
Товар по теме: [product strict=»(бактериофаг»](бактериофаг)
Что такое бактериофаги простыми словами
В 1928 году британский бактериолог Александр Флеминг вернулся из отпуска в Шотландии в свою лабораторию в Лондоне и обнаружил, как в одной из чашек Петри бурно разрослась колония плесневых грибов (Penicillium notatum). С выделением пенициллина началась эра антибиотиков.
С тех пор антибиотики спасли миллионы жизней по всей планете. Флеминг также обнаружил, что бактерии обладали устойчивостью к антибиотикам, если действовали малым количеством пенициллина, либо если антибиотик употреблялся слишком короткое время.
Алмрот Райт предсказал устойчивость к антибиотикам еще до того, когда это было обнаружено экспериментально. Бактериальная резистентность — явление естественное по своей природе, а потому неизбежное.
Вот уже более десятка лет Всемирная организация здравоохранения, Центр по контролю заболеваний в США, многие крупные эксперты в России открыто признают, что мы вступили в так называемую пост антибиотиковую эру.
В 2016 году в США зафиксирован случай заражения человека одной из разновидностей энтеробактерий. Штамп оказался устойчивым к воздействию тетрациклина, колистина, ко всем до единого из 26 видов антибиотиков, представленных на рынке. Женщину так и не удалось спасти.
Ученые по всему миру продолжают изучать явление резистентности в надежде минимизировать угрозы. Однако одной из самых подходящих альтернатив можно назвать препараты (комбинированные или моно) на основе бактериофагов.
Бактериофаги являются важнейшим компонентом нашей продукции и помогают при профилактике бактериальных заболеваний и борьбе с ними. Название звучит непривычно и немного непонятно. На самом деле, с бактериофагами люди знакомы уже более ста лет.
Бактериофаг в переводе с греческого означает «пожиратель бактерий». Не самое доброе «существо», но в действительности никто никого не пожирает. Бактериофаги — это природные агенты, которые естественным образом ограничивают размножение бактерий. Они способны избирательно устранять только те бактерии, которым они соответствуют, при этом не повреждая нормофлору или человеческие клетки.
Они являются самым распространенным биологическим объектом на Земле.
Бактериальные вирусы были открыты дважды: в 1915 году Фредериком Уильямом Туортом и в 1917 году Феликсом Д’Эреллем, который и предложил термин «бактериофаг».
Второе открытие было сделано во время исследования вспышки дизентерии среди французских солдат во время Первой мировой войны. При изучении лизиса (разрушения клетки под действием собственных или чужеродных ферментов) бактериальных культур.
Ученый обратил внимание, что какое-то существо, невидимое в обычный микроскоп, разрушает выращенные им культуры бактерий. Микробиологу удалось настроить его размножение: бактерии, зараженные им, погибали, а количество агента увеличивалось.
В 1919 году ученый успешно вылечил бактериофагами первых пациентов. Он описал случай успешного лечения дизентерии с использованием фагов, доказав, что они обеспечивают выздоровление больного организма. Были проведены и первые опыты по применению фагов при раневых инфекциях, холере, тифе и даже бубонной чуме. Успех выглядел вполне убедительно.
После открытия бактериофаги начали использовать для борьбы с бактериальными патогенами. Однако в Западной Европе и США от такой терапии вскоре отказались из-за сомнительных результатов. Это было неудивительно, принимая во внимание тогдашний уровень понимания биологии бактериофагов и отсутствие стандартизации. А открытие в 1928 году пенициллина и последовавшая за этим событием «эра антибиотиков» надолго отодвинули интерес к профилактическому и медицинскому использованию бактериофагов.
Хотя в государствах Восточной Европы, таких как СССР, применение бактериофагов в терапии продолжилось, чему способствовало основание в 1934 году Института Бактериофага в Тбилиси Георгием Элиавой совместно с Феликсом Д’Эреллем.
В мире интерес к фаговой терапии возобновился только в 1980-е годы, когда эффективность лечения антибиотиками значительно снизилась, а бактерии стали более устойчивы к лекарствам. Сейчас исследования в этой области активно ведутся по всему миру.
Золотистый стафилококк и стафилококковый бактериофаг из 2D в 3D
Автор
Редакторы
Видео на конкурс «Био/Мол/Текст»: В школе на уроках биологии, в книжках и на плакатах мы часто видели разные типы клеток. Но видели их только как картинки. Однако сейчас, с помощью виртуальной реальности, можно погрузиться в мир, где идет борьба между вирусами и бактериями. Приглашаем вас окунуться в этот микромир и насладиться им сполна.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Наглядно о ненаглядном» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Немного о VR
В видео есть часть, где представлена VR-работа. Чтобы лучше понять, что где находится — прочитайте, пожалуйста, описание ниже:
Золотистый стафилококк
Стафилококки — грамположительные и не спорообразующие кокки, которые образуют пары, короткие цепочки или гроздья. Род Staphylococcus содержит много видов, которые отделяются друг от друга на основе продукции фермента коагулазы [1].
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) — коагулазоположительный вид, является одним из самых вирулентных видов.
Вирулентность (от лат. virulentus — «ядовитый») степень способности инфекционного агента (штамма микроорганизма или вируса) вызывать заболевание или гибель организма.
Золотистый стафилококк — часто безвредный обитатель эпителия кожи и слизистых оболочек человека, но также связан с серьезными системными и местными инфекциями [2] и является одной из наиболее распространенных причин пищевых инфекций во всем мире. S. aureus производит 15 энтеротоксинов.
Энтеротоксины бактериальные токсины, которые вызывают секрецию жидкости из клеток кишечника.
Борьба с золотистым стафилококком
Борьба с бактериями велась издавна. Люди пробовали лечить раны растениями. И методом проб и ошибок подбирали нужные противомикробные лекарства [3].
Однако настоящая борьба с бактериями началась после открытия Александром Флемингом пенициллина в 1928 году. А уже в 1929 году вышла статья Флеминга в British Journal of Experimental Pathology. Хотя до Флеминга пенициллин «открывали» уже несколько раз, но ученые того времени всего лишь писали доклады, делали заметки, но не публиковали результаты в научных журналах [4]. Открытый гриб убивал стафило- и стрептококков и даже дифтерийную палочку [5].
Уже в 1940 году появились первые сведения об устойчивости бактерий к пенициллину.
Бактериофаг
В 1919 году, еще до обнаружения пенициллина, Феликс Д’Эрелль открыл совершенно другой метод борьбы с бактериями. Но потом он так и не смог конкурировать с антибиотиками. Речь идет о бактериофаговой терапии.
Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые используют для размножения только прокариотические клетки. Эти вирусы встречаются в природе повсеместно [6]. S. aureus был одним из первых организмов, использованных для демонстрации существования бактериофага [2].
В 1920–1940-е годы проводили множество исследований по клиническому применению бактериофагов, но стабильных результатов получено не было. На Западе от бактериофаговой терапии начали отказываться [7].
Борьба золотистого стафилококка и бактериофага
Сейчас фаговые препараты представляют собой смеси нескольких бактериофагов. Мы остановимся на одном из стафилококковых фагов.
Фаг 80α — умеренный бактериофаг лямбда семейства Siphoviridae с геномом в виде двухцепочечной ДНК. 80α способен к генерализованной трансдукции, а также может выступать в качестве помощника для мобилизации островков патогенности SaPI [2], которые, как было показано, кодируют такие факторы вирулентности, как токсины синдрома токсического шока и коагулаза [1].
Как и у других бактериофагов, капсид 80α собирается в виде пустого предшественника — прокапсида. Горсти фаговой ДНК упаковываются в прокапсиды через портальную вершину в АТФ-зависимом процессе, который требует малых и больших субъединиц фермента терминазы. Упаковка ДНК сопровождается расширением капсида и структурной перестройкой оболочки.
Для бактериофаговой терапии рекомендуется использовать те бактериофаги, которые идут по литическому пути развития (с разрывом клетки).
Бактериофаговые препараты
Сейчас с развитием современных методов генной инженерии и молекулярной биологии бактериофаговая терапия оживает в новых исследованиях. И на данный момент бактериофаговая терапия применяется очень осторожно и строго контролируемо, во избежание повторения истории с антибиотиками.
Однако не везде соблюдаются такие строгие стандарты. В Западной Европе после открытия антибиотиков от использования бактериофагов довольно быстро отказались. В Восточной Европе, несмотря на отсутствие крупных и контролируемых клинических испытаний, они оставались относительно популярным лечением в XX веке [8].
В СССР продолжали изучение бактериофагов. Это привело к тому, что в странах постсоветского пространства накопилась большая их коллекция. Сейчас, когда западные страны только начинают присматриваться к бактериофаговой терапии для лечения золотистого стафилококка и выписывают их заболевшему человеку в редких случаях под строгим наблюдением врача [9], в России бактериофаги в качестве лекарственного препарата используют довольно активно. И могут выписывать такие препараты «с легкой руки» при том, что их эффективность не доказана [10–16]: большинство российских исследований бактериофагов ограничено 30–40 участниками — такие исследования не являются доказательными. К сожалению, такое халатное использование препаратов может привести к увеличению случаев резистентности бактерий.
Очень важно относиться к бактериофагам с особой осторожностью. Иначе в скором времени мы увидим новость «Бактерии резистентны к бактериофаговой терапии».
Бактериофаг, мы тебя видим!
Прошло сто лет с того времени, как английский микробиолог Ф. Туорт отметил прозрачные стекловидные пятна в колониях микрококков, где погибли бактериальные клетки. После открытия бактериофагов их исследования долгое время имели феноменологический характер из-за недостаточного развития экспериментальных методов. Ученые не имели возможности детально изучить особенности противобактериального воздействия бактериофагов, так как последние нельзя увидеть не только невооруженным глазом, но и с помощью светового микроскопа. Изучение вирусов, в том числе вирусов бактерий, вышло на принципиально новый уровень лишь с созданием и внедрением в научную практику электронного микроскопа
С появлением электронной микроскопии стало понятно, что бактериофаги являются даже не микро- а наноорганизмами, так как их размеры не превышают 100 нм. Также оказалось, что по своему строению они отличаются колоссальным разнообразием. Соответственно, возник вопрос об их номенклатуре. В основу первой классификации, которая была предложена еще в 1943 г., легли особенности строения фагов, установленные с помощью электронной микроскопии. Один из ее основоположников, Э. Руска, в своей общей схеме классификации вирусов выделил бактериофаги отдельно, разделив их на три типа по морфологическим характеристикам (Ackermann, 2009).
В основу современной систематики бактериофагов, созданной в 1967 г., легла классификация, включавшая шесть морфотипов. Но по мере открытия новых бактериофагов в нее включались новые семейства, роды и виды. С развитием методов молекулярной биологии появились дополнительные критерии классификации, учитывающие тип нуклеиновой кислоты и (или) композицию белков в составе фага.
Применение в исследованиях бактериофагов современных молекулярных методов, позволило выявить множество особенностей этих интересных организмов. Сами бактериофаги в свою очередь оказались для молекулярных биологов очень полезным методологическим инструментом (Brussow, 2013).
Была бы голова, а хвост будет
Бактериофаги, по сути, устроены сравнительно просто: каждый такой вирус представляет собой комплекс нуклеиновой кислоты и белков, упакованных особым образом. Форма их может быть причудлива, однако около 96 % всех известных бактериофагов имеют «хвостатый» фенотип (Matsuzaki et al., 2005): у них имеется «голова» икосаэдрической формы (белковый резервуар, где упакована нуклеиновая кислота) и «хвост» – белковая структура, где расположены элементы, способные прочно связываться с рецепторами (особыми белками или полисахаридами) на поверхности бактерии. Разные виды «хвостатых» бактериофагов различаются размерами «головы», длинной и тонкой структурой «хвоста».
Чтобы узнать вид бактериофага, нужно определить его ультраструктурные характеристики, для чего используют метод негативного контрастирования. Образцом может служить любая суспензия, содержащая фаги: вода из природного источника, смывы с кишечника животных или суспензия бактериальных клеток после инкубации с бактериофагом в условиях лаборатории. На каплю подготовленной суспензии помещают специальную медную сетку, покрытую тонкой полимерной пленкой, на которую и сорбируются бактериофаги. Затем сетку обрабатывают контрастирующим веществом (обычно уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовой кислотой), которое окружает частицы бактериофага и создает темный фон, на котором бактериофаги, имеющие низкую электронную плотность, становятся видны в электронном микроскопе.
На сегодняшний день с помощью электронной микроскопии описано свыше 6,3 тыс. бактериофагов (Ackerman, Tiekotter, 2012; Ackermann, Prangishvili, 2012). Оказалось, что далеко не у всех бактериофагов можно четко выделить «голову» и «хвост», а что касается их наследственного материала, то наиболее часто встречаются фаги с двуцепочечной ДНК. Систематика бактериофагов очень динамична, поскольку регулярно обнаруживаются новые фаги (Ackermann, 2007).
Охота на бактерию
Совершенствование методов электронной микроскопии позволило визуализировать не только сами бактериофаги, но и процесс их размножения. Наиболее детально исследован процесс проникновения в клетку «хвостатых» бактериофагов, описаны молекулярные механизмы «впрыскивания» фаговой ДНК в цитоплазму бактериальной клетки (Guerrero-Ferreira, Wright, 2013).
Типичное поведение бактериофага при «нападении» на бактерию можно проследить на примере лизирующего фага. Сначала фаг прикрепляется к поверхности бактерии, используя ее рецепторы в качестве «якоря». Затем его «хвост» с помощью специальных белков внедряется в бактериальную стенку – образуется «канал», по которому нуклеиновая кислота фага вбрасывается в клетку. В течение следующего получаса в клетке бактерии происходит синтез белковых и нуклеиновых компонентов фагов и сборка новых фаговых частиц. После этого клетка разрушается, освобождая зрелые вирионы.
Сочетание методов негативного контрастирования и ультратонких срезов* позволяет проследить все этапы воспроизводства бактериофагов, включая сорбцию частиц фага на поверхности бактериальных клеток, их проникновение в клетки и копирование. К сожалению, эта область исследований разработана существенно хуже, чем визуализация и идентификация бактериофагов методом негативного контрастирования. Между тем ультраструктурные характеристики каждого из этапов жизненного цикла бактериофагов могут быть полезны для адекватной оценки эффективности разрабатываемых методов фаговой терапии.
Бактериофаги, несомненно, представляют собой уникальное явление на нашей планете: с одной стороны, они просто устроены, с другой – характеризуются колоссальным разнообразием как своей морфологии, так и своих потенциальных «жертв».
Для нас эти наноорганизмы не только безопасны, но и «дружествены», так как способны убивать патогенные бактериальные клетки, не затрагивая при этом клетки высших организмов, включая человека, а также сельскохозяйственных животных или растений. Это свойство позволяет использовать бактериофаги для терапии бактериальных инфекций, следуя принципу «враг моего врага – мой друг».
Перспективность фаговой терапии определяется не только самим фактом уничтожения бактерий фагами, но и высокой специфичностью взаимодействия фаг-«хозяин». Наконец, поскольку речь идет о природном феномене, человек может воздействовать на патогенные бактерии, не применяя вредные химические агенты.
* При методе ультратонких срезов клетки заливают в особую смолу, и из получившихся твердых блоков готовят срезы толщиной 60—80 нм на ультрамикротоме с помощью стеклянного или алмазного ножа
Ackermann H. W., Prangishvili D. Prokaryote viruses studied by electron microscopy. 2012. N. 157. P. 1843—1849.
Ackermann H. W., Tiekotter K. L., Murphy’s law – if anything can go wrong, it will // Bacteriophage. 2012. N. 2:2. P. 122—129.
Bacteriophages methods and protocols / Ed. A. M. Kropinski, R. J. Clokie. Humana Press, 2009. V. 1.
Duckworth D. H. Who discovered bacteriophage? // Bacteriological reviews. 1976. V. 40. N. 4. P. 793—802.
Introduction: a short history of virology // Viruses and man: a history of interactions / Ed. M. W. Taylor. Springer, 2014. P. 1—21.
Krylov V. N. Phage therapy in therms of Bacteriophage genetics: hopes, prospects, safety, limitation // Rus. J. of genetics. 2001. V. 37. N. 7. P. 869—887.
Matsuzaki S., Rashel M., Uchiyama J., et al. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infectious deseases // J. Infect. Chemother. 2005. N. 11. P. 211—219.
В публикации использованы фото авторов и рисунки Жени Власова