Как вырастить дрожжи для микроскопа
Лабораторная работа «Изучение клеток дрожжей под микроскопом»
«Проектирование урока в 9 классе в условиях реализации ФГОС по теме «Изучение клеток дрожжей под микроскопом»
Автор учитель биологии ГБОУ Российская Гимназия при ГРМ Центрального района
«Изучение клеток дрожжей под микроскопом».
Цель работы: Изучить строение и размножение дрожжевых клеток
Оборудование: микроскоп, предметное и покровное стекла, пробирка с водой, дрожжи, пипетка, салфетка, простой карандаш, тетрадь.
Раздаточный материал : инструктивные карточки, рисунок дрожжевой клетки, тексты, таблицы.
- Строят рассуждения, анализируют, сравнивают, делают выводы Самостоятельно организовывают свое рабочее место, планируют подготовку к работе Формируют интерес к изучению объектов природы, получают знания об основах здоровья-сбережения при использовании микроскопических грибов
- Планируют свою деятельность для достижения результата, осуществляют самоконтроль Умеют выбирать информацию и работать по алгоритму, проводить сравнение Развивают умение самостоятельно проводить исследование в ходе лабораторной работы и на основе анализа полученных результатов делать выводы Умеют непосредственно общаться с одноклассниками и учителем, умеют задавать вопросы и слушать мнение других Совершенствуют навыки наблюдения, выполнения рисунков, описания увиденных объектов, анализ и обобщение полученной информации
- Научатся выделять признаки таких биологических объектов как дрожжи, процессов их жизнедеятельности (роста и размножения) Объяснять их роль в природе и жизни человека Распознавать на рисунках элементы строения Сравнивать разные биологические объекты Овладеют методами биологической науки : рисование биологических объектов с обозначениями, постановка биологического эксперимента Закрепят умение работать с микроскопом
Подготовка к работе Учитель может сам подготовить все необходимое, либо создать группу лаборантов из наиболее активных ребят, либо дать задание для учеников на предыдущем занятии.
Можно подготовить раздаточный материал в виде рисунков с изображением грибов, можно воспользоваться рисунками в учебнике или, если это позволяет оборудование кабинета, подготовить рисунки и микрофотографии для выведения на экран Для экономии времени можно распечатать готовые бланки для заполнения таблицы.
Подготовка натуральных объектов перед уроком : Для получения культуры дрожжей в сосуд объемом 100-200 мл налить нагретого до 40-50 градусов молока, добавить кусочек сахара и примерно 10 г дрожжей, Все перемешать и поставить на 15 минут в теплое место.
Начало урока. ( игра «Черный ящик»)
В этом черном ящике находится объект, который вы можете купить в продуктовом магазине. Продаются они в виде порошка и брикетов. Это живой объект, вероятно, один из наиболее древних «домашних организмов». Места обитания этого объекта связаны преимущественно с богатыми сахарами субстратами : поверхностью плодов и листьев, где они питаются выделениями растений, нектаром цветов, однако они распространены также в почве (особенно в подстилке) и природных водах. А ваши бабушки и мамы добавляют этот объект в тесто, когда пекут вам вкусные пирожки или хлеб. Что же находится в этом черном ящике?
Карточки с текстом.
Всего дрожжей насчитывается около 1500 видов.
Дрожжи впервые сумел разглядеть в микроскоп голландский натуралист Антонии ван Левенгук в 1680 году, но так и не понял, что перед ним живые организмы (из-за отсутствия в них движения).
Места обитания дрожжей связаны преимущественно с богатыми сахарами субстратами : поверхностью плодов и листьев, где они питаются выделениями растений, нектаром цветов, однако они распространены также в почве (особенно в подстилке) и природных водах.
В 1857 году французский микробиолог Луи Пастер доказал, что спиртовое брожение –не просто химическая реакция, а биологический процесс, производимый дрожжами.
Наиболее характерным типом вегетативного размножения для дрожжей является почкование.
Каплю раствора помещаем на предметное стекло.
Накрываем покровным стеклом и удаляем излишки жидкости фильтровальной бумагой (салфеткой).
Находим с помощью микроскопа среди дрожжевых клеток делящиеся. Наблюдаем за размножением дрожжей –образованием почки на материнской клетке.
Инструктивная карточка к лабораторной работе «Изучение клеток дрожжей под микроскопом».
Цель работы: Изучить строение и размножение дрожжевых клеток
Оборудование: микроскоп, предметное и покровное стекла, пробирка с раствором дрожжей, пипетка, салфетка, простой карандаш, тетрадь.
Как сделать препараты для детского микроскопа?
Образование и развитие наших детей. Форум многодетных родителей
Как сделать препараты для детского микроскопа? ⇐ Образование и развитие наших детей
Сообщение Вишенка » 10 фев 2011, 12:21
Сообщение nastja » 10 фев 2011, 13:39
Если увеличени микроскопа позволяет, можно увидеть простейших. Капнуть на предметное стекло тухлой или зацветшей воды, накрыть покровным стеклом и смотреть.
Если увеличение совсем маленькое, как у лупы, на предметное стекло можно класть мелких насекомых (до 2 мм), кристаллы соли, сахара (лучше делать насыщенный раствор и ждать, пока кристаллики выпадут, тогда препарат удобнее смотреть).
Напишите, какое увеличение, может, чего более подходящее придумаю.
Сообщение Вишенка » 10 фев 2011, 23:54
Сообщение тори1979 » 11 фев 2011, 00:42
Сообщение nastja » 11 фев 2011, 01:33
Для камней специальные микроскопы, для обычного учебного или лабораторного годятся только плоские прозрачные препараты.
Кстати, в некоторых фирмах краски можно купить в розницу за наличные, там же стёкла предметные и покровные.
Лабораторная работа «Изучение клеток дрожжей под микроскопом».
«Управление общеобразовательной организацией:
новые тенденции и современные технологии»
Свидетельство и скидка на обучение каждому участнику
«Изучение клеток дрожжей под микроскопом».
Цель работы: Изучить строение и размножение дрожжевых клеток
Оборудование: микроскоп, предметное и покровное стекла, пробирка с водой, дрожжи, пипетка, салфетка, рисунок дрожжевой клетки
Каплю раствора помещаем на предметное стекло. Накрываем покровным стеклом и удаляем излишки жидкости фильтровальной бумагой (салфеткой).
Рассматриваем препарат под микроскопом, находим дрожжевую клетку, рассматриваем ее форму и отдельные её части.
Находим с помощью микроскопа среди дрожжевых клеток делящиеся. Наблюдаем за размножением дрожжей –образованием почки на материнской клетке.
Всего дрожжей насчитывается около 1500 видов.
Дрожжи впервые сумел разглядеть в микроскоп голландский натуралист Антонии ван Левенгук в 1680 году, но так и не понял, что перед ним живые организмы (из-за отсутствия в них движения).
Места обитания дрожжей связаны преимущественно с богатыми сахарами субстратами : поверхностью плодов и листьев, где они питаются выделениями растений, нектаром цветов, однако они распространены также в почве (особенно в подстилке) и природных водах.
В 1857 году французский микробиолог Луи Пастер доказал, что спиртовое брожение –не просто химическая реакция, а биологический процесс, производимый дрожжами.
Наиболее характерным типом вегетативного размножения для дрожжей является почкование.
Как перестать бояться и научиться размножать дрожжи в своей пивоварне
Выберите лучшие дрожжи для вашего напитка
О размножении дрожжей и простых способах для их умножения на малом пивном производстве рассказывается в статье Дрожжевой лаборатории supervised by Hefebank Weihenstephan.
Огромную роль в получении качественного пива играет качество дрожжей. Дрожжевая масса, полученная после брожения, может быть использована несколько раз, однако дрожжи в процессе их использования могут загрязняться, мутировать, терять свои свойства. И лучшим способом этого избежать является использование чистой культуры дрожжей.
Размножение дрожжевой клетки предполагает наличие соответствующей питательной среды (состава сусла).
При размножении дрожжей решающее значение имеют: температура, давление, штамм, кислород, аминокислоты, микроэлементы, концентрация углеводов, липиды, стерины.
При размножении дрожжей различают следующие стадии:
Для разведения чистой культуры дрожжей клетки изолируют и размножают в стерильных условиях, пока их количества не хватит для использования в бродильной емкости предприятия. При этом продолжительность генерации (время, необходимое для удвоения числа клеток) в период интенсивного роста составляет, в зависимости от различных факторов, 6-9 часов.
В 1883 году Эмиль Хансен впервые пропагировал дрожжевую культуру. Он выделил одну дрожжевую клетку, а затем размножил ее шаг за шагом. Этот способ пропагации был усовершенствован со временем, и сейчас возможно пропагировать специальные культуры дрожжей со специфическими свойствами, необходимыми каждой отдельной пивоварне.
Цель этой статьи – показать, что размножение дрожжей из чистых стартовых культур вполне выполнимо в условиях любых пивоварен, даже самых маленьких.
Но, перед тем как перейти к методикам пропагации на малых предприятиях, необходимо рассмотреть лабораторные методики.
Традиционное разведение чистой культуры дрожжей проводят следующим образом:
Изолируют клетки дрожжей на стадии высоких завитков по методу Линднера (изолируются капли под микроскопом). При температуре 8-10 °С культуре дают развиваться. Под микроскопом выбирают самую сильную колонию, культура промокается фильтровальной бумагой, бумага помещается в пробирку, наполненную 5 мл стерильного сусла.
Если культуру не используют сразу, то клетки хранят на твердой питательной среде, например, на скошенном сусло-агаре под парафиновым маслом 6-9 месяцев при температуре 0-5 °С, или в жидком азоте (криоконсервация).
Умножение дрожжей ведется путем перелива культуры на стадии высоких завитков в следующую емкость при отношении объемов 1:10. Начиная с объема 10 л, на заводах используются металлические емкости (например, колбы Карлсберга).
Дальнейшее разведение происходит на производстве в установках чистой культуры (пропагаторах) или открытым способом (применяется на малых предприятиях).
Умножение культуры со скошенного сусло-агара при температуре 18-22 °С
Скошенный сусло-агар => 100 мл => 1000 мл => 10 л => 100 л => 1000 л
Умножение культуры в 10 раз при температуре 18-22 °С за 24 часа
500 мл => 20 л => 200 л => 2000 л
Использование скошенного сусло-агара требует лабораторных условий, и поэтому не применимо на малых пивоварнях.
Для того чтобы пивовар за пару суток смог получить объем дрожжей, необходимый для задачи в партию сусла, лаборатория Hefebank Weihenstephan в Санкт-Петербурге выполняет у себя все предварительные стадии, доводя концентрацию дрожжевых клеток до высоких значений и предлагая чистую культуру в объеме 500 мл.
Дрожжи помещаются в банку в лог-фазе, то есть когда они имеют самый высокий потенциал к умножению. Поскольку до пивоварни в любом российском городе дрожжи доставляются в холоде, быстрый старт их работы гарантирован.
Хотя у малых пивных предприятий значительно отличаются объемы варки, для успешного применения дрожжевой культуры Hefebank Weihenstephan в любом случае требуется только одна банка. Нужный для задачи в партию сусла объем дрожжей может быть выращен на самом производстве, без вложений в дорогостоящее оборудование.
В 500-миллилитровой банке от Дрожжевой лаборатории Hefebank Weihenstephan содержится порядка 200 млрд клеток дрожжей.
В любом случае, для того чтобы определить, сколько нужно дрожжей для вашего предприятия, нужно исходить из начальной концентрации дрожжевых клеток в начале брожения и объема вашей бродильной емкости.
Для низовых штаммов рекомендуется задавать 1-1,2 млн клеток/мл на каждый градус Плато сусла, а для верховых дрожжей — 0,5-0,75 млн клеток на мл на каждый градус Плато сусла.
Пропагация в кеге
Металлические пивные кеги присутствуют почти на любом пивоваренном производстве, и поэтому использование кега в качестве пропагатора является одним из самых простых решений. Лучше выделить для размножения дрожжей отдельный кег и проявить особое внимание к его мойке.
Относительно надежным способом обработки кега в условиях слабо оборудованных пивоварен является его наполнение горячим щелочным раствором через заборную головку. Заправленный таким раствором кег нужно перевернуть, чтобы верхняя часть фитинга оказалась погружена в раствор, и оставить на продолжительное время (на ночь). Затем через заборную головку необходимо подать чистую воду, чтобы полностью вытеснить щелочной раствор (убедиться в отсутствии щелочи можно при помощи лакмусовой бумаги).
Для пропагации подходит любое сусло, обычно производимое пивоварней, хотя желательно использовать светлое сусло с невысокой экстрактивностью. Можно регулировать экстрактивность сусла в кеге доливом горячей воды.
Следует помнить, что теплообменник для охлаждения сусла является критической точкой каждой пивоварни, и поэтому более безопасно наполнять кег горячим суслом, взятым до теплообменника.
Если у пивоварни нет цикличности производства, то сусло в кегах можно подготовить заранее и хранить в холодильной камере несколько дней до использования (горячее сусло само по себе стерилизует кег, и такая степень микробиологической чистоты может считаться достаточной для малой пивоварни). Желательно наполнять кег суслом до самого верха и хранить в перевернутом виде.
Если сусло предполагается использовать в скором времени, то кег можно оставить в помещении примерно на 12 часов – обычно этого достаточно для охлаждения сусла до комнатной температуры, при которой проводится пропагация. Если сусло было убрано для хранения в холодильник, то необходимо достать его заранее, чтобы, опять же, довести температуру сусла до комнатной.
Перед внесением дрожжей необходимо слить 1/3 сусла, чтобы обеспечить место для подъема пены при работе дрожжей.
В случае использования горячего сусла, взятого до теплообменника, риск микробиологического заражения довольно низок. Но если сусло набирается после теплообменника, сразу с температурой, подходящей для пропагации (20-25 °С), то необходимо иметь уверенность в том, что теплообменник соответствующим образом вымыт и продезинфицирован.
Внесение дрожжей в кег возможно через открученный фитинг или через «микроматик». Для удобства задачи лаборатория supervised by Hefebank Weihenstephan готова предложить специальное устройство для подсоединения банки дрожжей к «микроматику» с одновременной аэрацией.
Пропагация в дрожжанке (баке)
Наиболее простой для многих пивоваров может показаться процедура пропагации в дрожжевом баке.
После того как емкость вымыта и продезинфицирована, в нее необходимо подать сусло.
Если сусло берется после теплообменника, и в малом объеме сложно обеспечить необходимую температуру, то можно взять сусло с более высокой температурой, а затем добавить чистую холодную воду, охладив сусло до оптимальной для пропагации температуры (20-25 °С).
Рекомендуется оставлять достаточно места в дрожжанке (баке) для подъема пены при начале работы дрожжей.
Для задачи в дрожжевой бак не требуется специальных устройств – необходимо только встряхнуть банку и влить дрожжи в сусло, а затем вручную перемешать и (желательно) проаэрировать сусло.
Преимуществом использования такого метода является его наглядность: уже через несколько часов на поверхности появляется забел, а затем завитки. По завиткам (восходящие, нисходящие) можно судить о стадии брожения.
Вносить весь объем в партию сусла лучше в тот момент, когда дрожжи находятся в фазе роста (при высоких завитках на поверхности).
Точные расчеты для умножения дрожжей до необходимого объема каждая пивоварня может произвести сама, руководствуясь указанной выше формулой.
Также специалисты Дрожжевой лаборатории готовы проконсультировать по вопросам ведения чистой культуры и методикам пропагации.
Освоив размножение дрожжей на своем предприятии, можно значительно сэкономить, а главное – уйти от ряда проблем, связанных с применением сухих дрожжей, среди которых самой очевидной является отсутствие разнообразия штаммов.
Не все дрожжи могут быть высушены, но зато все пивоварни могут работать с чистой жидкой культурой!
Подробную инструкцию по пропагации, а также информацию об основных штаммах Дрожжевой лаборатории supervised by HefebankWeihenstephan, можно найти на сайте yeastlab.ru.
Дрожжевая лаборатория supervised by Hefebank Weihenstephan:
Как приготовить микропрепарат дрожжей
Дрожжи, вероятно, одни из наиболее древних «домашних организмов». Тысячи лет люди использовали их для выпечки. Предполагается, что пиво египтяне начали варить за 6000 лет до н. э., а к 1200 году до н. э. овладели технологией выпечки дрожжевого хлеба наряду с выпечкой пресного.
В 1680 году голландский натуралист Антони ван Левенгук впервые увидел дрожжи в оптический микроскоп. Однако, из-за отсутствия движения, не распознал в них живые организмы. Лишь в 1857 году французский микробиолог Луи Пастер доказал, что спиртовое брожение — не просто химическая реакция, а биологический процесс, производимый дрожжами.
Что делаем. На предметное стекло нанесите каплю воды. Пользуясь препаровальной иглой, поместите маленький кусочек дрожжей и всё тщательно перемешайте. Накройте препарат покровным стеклом.
Что наблюдаем. Видно множество овальных или продолговатых клеток. Клетки лежат отдельно или соединены в цепочки, часто ветвящиеся.
Внутри клеток заметны вакуоли и капли жира.
Цепочки образуются в результате почкования.
Для изучения микроорганизмов производят микроскопирование как живых, так и убитых микробов в неокрашенном и окрашенном виде. Микроскопический препарат готовят на предметном стекле – пластинке из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями. Предметные стекла, употребляемые при микробиологическом исследовании, должны быть кристально чисты и абсолютно обезжирены. На поверхности обезжиренного стекла вода легко расплывается и не образует капель шаровидной формы.
Новые стекла перед употреблением кипятят в 1%-ном растворе соды 10 мин, промывают водой, слабой соляной кислотой и хорошо прополаскивают в дистиллированной воде. Стекла, бывшие в употреблении, необходимо обработать раствором серной кислоты в течение 2 ч, хорошо промыть в воде и прокипятить 10 мин в 4%-ном растворе соды. Ополоснутые затем дистиллированной водой стекла протирают чистой полотняной тряпочкой.
В лаборатории всегда следует иметь запас готовых для работы стекол. Хранить предметные стекла лучше всего в банке с притертой пробкой, погруженными в смесь спирта с эфиром, взятых в равных объемах. Из банки предметные стекла достают пинцетом. Покровные стекла – вырезанные квадратом или прямоугольником тонкие стеклышки (толщиной 0,15-0,17 мм) размерами 18х18 мм, 20х20 мм, 18х24 мм.
Исследование микроорганизмов в живом виде
Бактерии ввиду их малых размеров чаще рассматривают в мертвом виде на фиксированных окрашенных препаратах. При этом получается более ясное представление о форме и размерах клеток, о способности их к спорообразованию. В живом виде в «раздавленной» капле бактерии рассматривают в том случае, когда выясняют их способность к движению.
Препарат «раздавленная» капля. На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма (дрожжей или бактерий), взятой с твердой питательной среды. Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости, а при надобности добавляют каплю стерильной воды. Суспензия культуры микробов на стекле должна давать лишь слабую муть. При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и всю эту смесь тщательно размешивают. Прижизненная окраска дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку.
Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми м окрашены в синий цвет.
Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии можно рассматривать и без добавления краски. На поверхность покровного стекла наносится капля иммерсионного масла, и препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90 X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.
Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) специальной иглой (можно препаровальной) или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло. Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с объективом 8Х. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.) препарат рассматривают с объективом 40X. При этом обязательно следует регулировать освещение с помощью диафрагмы для получения более четкого изображения рассматриваемых деталей.
При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить следующее:
1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.
2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимают кусочком фильтровальной бумаги.
3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если пузырьков много, препарат следует приготовить заново.
4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.
5. Приготовленные препараты рассматривают немедленно (особенно живых бактерий), так как в противном случае вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.
6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки.
После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 сек, ни к чему не прикасаясь) и приступают к выполнению очередного этапа работы.
Исследование микроорганизмов в фиксированном и окрашенном виде
Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло платиновой петлей наносят материал (рис. 62). Если он жидкий, то каплю, взятую петлей, непосредственно равномерно распределяют по поверхности предметного стекла тонким слоем на площади примерно в 1 см2. Если же изучается агаровая культура, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильной воды, в которой тонким слоем распределяется исследуемая культура. Получается так называемый мазок. Все манипуляции по приготовлению мазка необходимо выполнять с соблюдением правил асептики (над пламенем горелки стерилизуют петли, концы сосудов с исследуемым материалом, ватные пробки и пр.). Сделав мазок, его сушат при комнатной температуре, поместив на специальный сушильный столик (рис. 63). Хороший мазок после сушки должен давать едва заметный налет. Препарат с густым мазком для наблюдения малопригоден.
Для ускорения высыхания можно осторожно подсушить мазок над пламенем горелки. Предметное стекло в этом случае над пламенем горелки держат так, чтобы мазок был обращен вверх.
Окраска мазков. В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Сложные, или дифференциальные, способы окраски, как уже указывалось, применяются для детального изучения структуры клеток. При простой окраске препаратов на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо красящего раствора (метиленовой сини, разведенного фуксина и пр.). Для получения более чистых препаратов рекомендуется красящий раствор наливать на отрезок фильтровальной бумаги, которой покрывают мазок. Раствор краски в среднем выдерживают на мазке 2-3 мин (в зависимости от вида краски). Фуксин красит интенсивно, причем окрашиваются одинаково хорошо все виды бактерий. Продолжительность окрашивания раствором фуксина вполне достаточна на протяжении 1-2 мин. Щелочную метиленовую синь оставляют для окрашивания мазка на 2-3 мин. Она красит менее сильно, но препарат получается более изящный, к тому же различные бактерии приобретают окраску различной интенсивности. При окраске метиленовой синью у крупных клеток (например, дрожжевых) дифференцируется ядро и цитоплазма. Раствор генцианвиолета держат для окраски 3-5 мин.
По истечении указанного срока краску сливают с предметного стекла. Если на мазок помещалась фильтровальная бумага, ее нужно осторожно снять пинцетом и затем промыть мазок легкой струей дистиллированной воды (можно и водопроводной). Струю воды следует направлять на ребро предметного стекла, а не на мазок. Промытый препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре или с помощью полосок фильтровальной бумаги.
На сухой мазок наносят каплю кедрового масла. Не следует кедровое масло наносить на влажный (а тем более на мокрый) мазок. При этом возникает эмульсия воды в кедровом масле и четкость изображения в микроскопе резко снижается.
Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя и большим количеством контрастных красок. В микробиологической практике сложный метод окраски микробов по Граму имеет весьма важное значение при дифференциации микробов.
Техника окраски микробов методом Грама состоит в следующем. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый раствор генцианвиолета на 1-2 мин. Затем краску сливают. Сняв бумажку и не промывая препарат водой, наносят на мазок раствор Люголя также на 1-2 мин (мазок чернеет). По истечении указанного времени раствор Люголя сливают с предметного стекла и погружают стекло в стаканчик со спиртом для обесцвечивания. Предметное стекло слегка покачивают в спирте, выдерживая 30-60 сек. Быстро промывают мазок водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 мин. Фуксин сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Выполнить окраску микробов по Граму можно, пользуясь модификацией этого метода, предложенной Синевым. Вместо раствора карболового генцианвиолета используют фильтровальную бумагу, пропитанную этим раствором и высушенную. На фиксированный мазок накладывают полоску такой бумаги, наносят несколько капель стерильной воды, так чтобы бумажка оказалась смоченной, и окрашивают препарат в течение 2 мин. Затем бумажку снимают, на препарат наливают раствор Люголя и далее поступают так же, как указано выше при окраске по Граму.
По отношению к окраске по Граму все бактерии разделяют на две группы: грамположительные (грампозитивные) и грамотрицательные (грамнегативные). Первые в результате окраски остаются окрашенными в фиолетовый цвет; вторые – обесцвечиваются спиртом и при дополнительном окрашивании фуксином приобретают красный цвет. Объясняется это тем, что у грамположительных бактерий в цитоплазме клеток содержатся специфические белки и магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которые с генцианвиолетом и йодом образуют комплекс фиолетового цвета, не разрушающийся под действием спирта. У грамотрицательных бактерий магниевая соль рибонуклеиновой кислоты в клетках отсутствует, и такого комплекса при окраске генцианвиолетом и йодом в цитоплазме не образуется. Генцианвиолет и йод в дальнейшем легко обесцвечиваются спиртом.
Приготовление красящих растворов
При бактериологическом исследовании для окраски микробов применяются основные анилиновые краски. Чаще всего употребляются: основной фуксин (красная краска), метиленовая синь (синяя краска), генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет (фиолетовые краски). Эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, из которых готовят красящие растворы.
Исходным материалом для приготовления необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы указанных красителей. Спиртовые растворы готовят впрок и сохраняют в склянках с притертыми пробками. Сами по себе спиртовые растворы для окраски микробов не применяются.
Насыщенный спиртовой раствор красителя получают растворением 1 г его в 10 мл 96%-ного этилового спирта (этанола). Краска обычно полностью не растворяется, и на дне флакона остается небольшой осадок. Полученный спиртовой раствор настаивают 3-5 дней, ежедневно взбалтывая.
Рабочий водно-спиртовой раствор краски получают смешивая 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды. Для повышения красящей способности в качестве протравы к водно-спиртовым растворам красок добавляют карболовую кислоту.
Рецепты приготовления наиболее употребительных красок.
Карболовый фуксин Циля. 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты. Можно приготовить красящий раствор и непосредственно из сухого красителя. Для этого 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты. Для лучшего растирания рекомендуется добавить несколько капель глицерина. Затем понемногу приливают 10 мл 96%-ного спирта. К равномерно растертой массе постепенно приливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 1-2 суток. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стоек и может сохраняться очень долго. Его употребляют для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий, трудно воспринимающих краску.
Фуксин Пфейфера (разведенный фуксин). 1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллированной воды. Раствор нестоек, поэтому его приготовляют непосредственно перед окраской препаратов. Используют для простой окраски мазков и дополнительной окраски их по методу Грама.
Карболовый генцианвиолет. 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты или 1 г генцианвиолета растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты, постепенно добавляют 10 мл 96%-ного спирта и 100 мл дистиллированной воды.
Щелочная метиленовая синь (по Лефлеру). К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-ного раствора едкого кали (КОН). Раствор фильтруют. Краска очень прочная, причем красящая способность старой краски выше, чем свежеприготовленной.
Водный раствор метиленовой сини. 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Раствор Люголя. 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавив 1 г кристаллического йода. Объем доводят водой до 300 мл. Раствор Люголя должен иметь слабощелочную или нейтральную реакцию. При кислой реакции его нейтрализуют (по лакмусу) двууглекислой содой. Раствор следует хранить в склянках из темного стекла, предохраняя от действия света.
Приготовление пропитанной генцианвиолетом фильтровальной бумаги для окраски микробов по Граму в модификации Синева. Раствор карболового генцианвиолета помещают на сутки в термостат при 37 °С, затем фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат выливают в тарелку и погружают в него нарезанную полосками фильтровальную бумагу на 1-2 мин. Пропитанная краской бумага подсушивается, нарезается кусочками (2х4 см) и сохраняется в темных склянках с притертой пробкой. Срок хранения неограниченный.
Примечание. Свежеприготовленные карболовые растворы красок имеют на поверхности пленку с металлическим блеском. Эти растворы стойкие и сохраняются довольно долго. Однако при слишком длительном хранении они могут стать непригодными; в этом случае металлический блеск на поверхности их пропадает, а на дне образуется мелкий порошкообразный осадок.
1. Приготовление микропрепаратов
Далеко не всё, что есть под рукой, имеет смысл класть на предметный столик и пытаться рассмотреть в окуляр микроскопа. Например, непрозрачные объекты (палец, монета) рассмотреть совсем не удастся, да и для рассматривания вполне достаточно сильной лупы.
Обычно для микроскопирования используют специально приготовленные микропрепараты. При приготовлении микропрепарата берется предметное стекло (размер 25 × 75 мм), на которое помещается рассматриваемый объект; обычно для лучшей сохранности и удобства использования объект накрывается сверху тонким покровным стеклом (размер 18 × 18 мм).
По способу приготовления и времени хранения различают:
В таблице представлены типы препаратов в зависимости от характера исследуемого объекта.
Описание
Постоянный/ временный
Пример
Целый организм или его небольшие части (конечности, ротовой аппарат). Обычно требуют обработки (осветления)
Объект заливается в пластичный материал (парафин, акрил) и после его затвердевания разрезается на тонкие пластины с помощью микротома (приспособления для получения тонких срезов)
Токослойный препарат без покровного стекла (обычно препарат крови): капля с помощью полированного стекла размазывается по поверхности предметного стекла тонким слоем, высушивается
Временный, реже постоянный
Тонкая (толщина 0,03-0,02 мм) пластинка горной породы или другого твердого образца (кости, окаменелости), приклеенная к покровному стеклу
В некоторых случаях временный препарат можно рассматривать непосредственно, не накрывая покровным стеклом. Такой препарат будет практически невозможно рассмотреть резко сразу весь – какая-то часть его будет в фокусе, а остальное – нет. Но если рассматривать такой препарат с малым увеличением микроскопа, можно рассмотреть некоторые интересные объекты.
Микропрепарат клеток мякоти арбуза (без покровного стекла)
Так же в виде открытых временных препаратов можно вырастить кристаллы разных солей (ацетилсалициловой кислоты, или аспирина; медного купороса, или сульфата меди; красной кровяной соли, или гексацианоферрата калия). На предварительно очищенное от пыли и отпечатков пальцев наносится несколько капель водного или спиртового раствора соли (для лучшего качества кристаллов раствор предварительно лучше профильтровать, так как это позволит уменьшить количество точек кристаллизации и получить более крупные и аккуратные кристаллы). Каплям дают высохнуть (можно провести эксперимент с одним из стекол, нагрев его, с целью ускорения выпаривания, а другому дать растворителю испариться, а кристаллам – выпасть самостоятельно). Также можно рассматривать полуготовый микропрепарат на этапе процесса кристаллизации: можно увидеть, как кристалл увеличивается прямо на глазах или как вокруг зародыша твердого вещества возникает течение жидкости из-за разницы концентраций ионов.
Простой и эффектный способ изготовления микропрепаратов без срезов, позволяющий рассмотреть рельеф поверхности изучаемого объекта (например, листа растения, покровов тела насекомого) – метод реплик. При этом берется объект (например, лист растения), и на него наносится тонкий слой прозрачного лака для ногтей (достаточно небольшого пятна 5 × 10 мм). После того, как лак высохнет (примерно через 5-7 минут), к лаковому пятну приклеивается кусок липкой ленты; так реплика отделяется, после чего ее кладут на предметное стекло и рассматривают под микроскопом.
Реплика поверхности листа, видны устьичные клетки и жилка
(микроскоп Микромед С-13, малое увеличение).
1.1. Приготовление временного препарата
Техника приготовления временного препарата хорошо известна по школьным опытам с кожицей лука. Кладем предметное стекло на стол (препараты всегда держат за боковые грани предметного стекла). В центр стекла помещаем 1-2 капли воды и объект исследования Берем покровное стекло за боковые грани и осторожно накрываем им сверху каплю с объектом. Правильнее упереть покровное стекло одной из граней в предметное и медленно уменьшать угол между стеклами так, чтобы накрыть каплю с объектом. Это уменьшает возможность появления пузырьков воздуха.
Накрывание объекта покровным стеклом
1.2. Приготовление мазка крови
Мазки крови для исследования крови готовят следующим образом.
Описание
Фотография
Поместите небольшую каплю крови на лежащее на горизонтальной поверхности предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки (или непосредственно из места укола пальца перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла, стараясь не касаться стекла проколотым участком кожи).
Чистое шлифованное стекло помещается коротким ребром под углом 45° к предметному стеклу у края капли. Ждем, пока кровь расплывется под ребром стекла.
Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводим по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом могут разрушиться форменные элементы крови.
После приготовления мазок быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска, подержав его над абажуром лампы или помахав им в воздухе. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Густо-розовые и красноватые мазки непригодны, так как они слишком толстые и клеточные элементы различить будет сложно.
2. Некоторые особенности микроскопирования
Использование микроскопов на малом и большом увеличении достаточно хорошо известно по школьным опытам и не требует особо сложных навыков.
2.1. Имерсионный объектив
Если в ващем распоряжении имеется микроскоп с иммерсионным объективом (он маркируется 100× МИ и черным кольцом, и имеет подвижную часть объектива, обращаемую к микропрепарату), то у вас есть возможность рассмотреть объекты с большим увеличением (однако для этого имеет смысл использовать мазки).
При работе с иммерсионным объективом потребуется максимальная освещенность. После окончания исследования иммерсионный объектив нужно протереть мягкой оптической тряпочкой или батистовой, слегка смоченной специальной жидкостью для чистки оптики. Важно: любые другие виды объективов протирать нельзя!
Применение вместо кедрового масла других масляных жидкостей не рекомендуется, т. к., если показатель преломления используемой иммерсии (например, вазелинового масла с показателем 1,48162) отличается от показателя преломления кедрового масла (показатель 1,515), возможно снижение контраста, нечеткость изображения, уменьшение разрешающей способности.
2.2. Фотографии в косом освещении и темном поле
Для объемных препаратов (тотальные препараты насекомых, водорослей и др.) интересно использовать освещение, отличное от обычного просвечивающего. Для регулировки освещения в микроскопах используется конденсор – поворотное устройство с отверстиями разного диаметра и расположения. Используя специальные варианты конденсора, можно изменить характер освещения препарата, подчеркнув объем рассматриваемого объекта.
В таблице сравнивается работа с освещением разных типов.
Тип освещения
Способ создания
Вид зрачка объектива с вынутым окуляром
Пример
Свет проходит через поле зрения равномерно.
Свет проходит через препарат под углом, так как конденсор закрывает часть отверстия. Этого эффекта можно добиться притеняя рукой или другой преградой часть светового потока перед зеркалом микроскопа
Специальный конденсор закрывает центральную часть поля зрения, так что свет проходит с краев. При определенной тренировке такого эффекта также можно добиться, частично притеняя часть светового потока перед зеркалом микроскопа
3. Съемка
Фотографирование настроенного на резкость микропрепарата с помощью камеры планшета особых трудностей не представляет, так как мы непосредственно контролируем то, что именно будем снимать. Настройки камеры планшета также зависят от типа устройства, которое вы используете; так как камера планшета обычно имеет достаточно большую глубину резкости, даже при настройках камеры по умолчанию можно получить вполне качественное изображение.
Планшетный компьютер и микроскоп: съемка, фотография, кадр с выносками и обозначениями
4. Интернет-ресурсы
Лекция по микроскопированию для студентов:
Простые опыты в домашних экспериментах:
Сайты с историческими микроскопами и микропрепаратами: